Внутриматочные синехии, впервые описанные Генрихом Фритцем в 1894 году, и по сей день представляют собой проблему репродуктивного здоровья женщин. Характеризуясь частичной или полной облитерацией полости матки фиброзной тканью, внутриматочные синехии могут стать причиной нарушений менструальной функции, привычного невынашивания беременности, бесплодия. Гистероскопический адгезиолизис является основным методом лечения данной патологии, однако высокая частота рецидива, достигающая 62,5%, требует поиска новых методов лечения и профилактики [1, 2]. Травма эндометрия по данным большинства авторов считается основной причиной формирования внутриматочных синехий, однако не исключена роль и других факторов, таких как инфекции, повышенная экспрессия цитокинов, гипоксия, снижение васкуляризации [3]. Кроме того, известны случаи формирования внутриматочных синехий без предшествовавшей травмы эндометрия [4].
Функциональный слой слизистой оболочки тела матки представляет собой ткань, обладающую высокими регенеративными свойствами, подвергающуюся росту, дифференцировке и отторжению на протяжении менструального цикла в течение всего репродуктивного возраста женщины. Колебания уровня циркулирующих эстрогенов и прогестерона поддерживают это состояние «ремоделирования эндометрия» [5]. Известно, что даже при относительно небольшой травме эндометрий может стать невосприимчивым к стероидным гормонам, что приводит к нарушению менструальной и репродуктивной функции, в частности при внутриматочных синехиях [2, 6].
В связи с этим мы провели исследование, целью которого стала оценка экспрессии эстрогеновых (ER) и прогестероновых (PgR) рецепторов в ядрах железистого эпителия и стромы эндометрия и внутриматочных синехий у женщин репродуктивного возраста.
Материал и методы исследования
На базе отделения оперативной гинекологии и патологоанатомического отделения ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России проведено проспективное исследование 30 пациенток репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями и 10 пациенток группы сравнения, обратившихся для подбора контрацепции, которые прошли полное клинико-лабораторное обследование и лечение в 2015–2016 гг. Все пациентки перед включением в исследование подписали добровольное информированное согласие. Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России.
По данным гистероскопии на основании классификации Американского общества фертильности (1988) для иммуногистохимического исследования пациентки были разделены на группы: 1-я группа – пациентки с внутриматочными синехиями I степени (n=10), 2-я группа – пациентки с внутриматочными синехиями II степени (n=10), 3-я группа – пациентки с внутриматочными синехиями III степени (n=10), 4-я группа – условно здоровые пациентки группы сравнения (n=10).
Критериями включения в основные группы являлись: возраст пациенток от 18 до 45 лет, наличие внутриматочных синехий, выявленных по данным гистероскопии и подтвержденных гистологическим исследованием, пролиферативная фаза менструального цикла. Критериями исключения из исследования были: возраст пациенток менее 18 и больше 45 лет, прием гормональных препаратов на момент обращения, тяжелая сопутствующая соматическая патология, злокачественные новообразования в анамнезе, острые воспалительные заболевания органов малого таза. Гистероскопический этап выполняли по стандартной методике в отделении оперативной гинекологии в условиях соответствующего анестезиологического обеспечения.
В качестве материала для исследования были использованы образцы эндометрия и внутриматочные синехии, полученные во время гистероскопии и биопсии эндометрия. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате Shandon и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки не превышало 48 часов. Парафиновые срезы толщиной 4–5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином.
Для иммуногистохимического исследования срезы толщиной 4 мкм наносили на высоко адгезивные предметные стекла и сушили в течение 18 часов при температуре 37°С. После снятия парафина со срезов их регидратировали в батарее спиртов 95, 80, 70, инкубируя в каждом растворе по 2 минуты. Восстановление антигенной активности проводили в PT Link («Dako») в буфере EnVision pH 9,0 в течение 20 минут при температуре 97°С. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали в 3% растворе перекиси водорода в течение 15 минут для блокирования эндогенной пероксидазы. Реакцию с первичными антителами проводили в течение 30 минут при комнатной температуре. В исследовании использовались моноклональные антитела к ER (clone 1D5, RTU, Dako, Denmark) и PgR (clone PgR636, RTU, Dako, Denmark). Для визуализации мест связывания антител с антигенами использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием водонерастворимого конечного продукта коричневого цвета системы «EnVision» («Dako Cytomation»). Для правильной постановки иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре иммуногистохимической реакции, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя. После проведения иммуногистохимических реакций срезы контрастировали гематоксилином и заключали в синтетическую среду «Shandon mount TM» (USA). При оценке результатов иммуногистохимических реакций учитывали ядерное окрашивание клеток и использовали полуколичественный метод H-Score по формуле S=1а+2b+3c, где а – % слабо окрашенных ядер, b – % умеренно окрашенных ядер, с – % сильно окрашенных ядер. При этом интенсивность коричневой окраски от бледно-окрашенных ядер до интенсивно окрашенных ядер оценивалась по рекомендации McClelland [7]. Постановка диагноза «внутриматочные синехии» осуществлялась согласно рекомендациям ВОЗ.
Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics 17.0. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.
Результаты исследования
Средний возраст женщин в 1-й группе составил 34,5±7,45 года, во 2-й группе – 30,6±6,06 года, в 3-й группе – 33,9±4,8 года, в 4-й группе – 32,00±5,14 года. Средний возраст наступления менархе составил 12,8±1,07 года в 1-й группе; 12,2±1,16 года – во 2-й группе; 13,3±1,2 года – в 3-й группе; 12,5±1,3 года – в 4-й группе. Длительность менструаций – от 3 до 5 дней, в среднем 5,76±1,43 дня в 1-й группе; 4,80±0,77 дня – во 2-й группе; 5,5±1,3 дня – в 3-й группе; 5,2±1,4 дня – в 4-й группе. Продолжительность менструального цикла варьировала от 26 до 30 дней, составляя в среднем 28,35±0,70; 29,87±4,42; 30,5±2,0; 30,5±3,1 дня соответственно.
Анализ перенесенных оперативных вмешательств выявил высокую частоту диагностического выскабливания слизистой полости матки в анамнезе у пациенток основной группы: у 6 (60%) пациенток 1-й группы, 7 (70%) пациенток 2-й группы, 10 (100%) пациенток 3-й группы.
При морфологическом исследовании эндометрия у 30 пациенток 1–3-й групп в 25 (83,3%) случаях был выявлен хронический эндометрит, который был представлен рассеянной и мелкоочаговой лимфоидной инфильтрацией вокруг желез и мелких сосудов. В состав лимфоидного инфильтрата входили плазматические клетки и макрофаги. На отдельных участках отмечались выраженные фиброзные изменения стромы и признаки неоангиогенеза. Кроме того, следует отметить гиперплазию базального слоя эндометрия, выявленную в 1–3-й группах: в 11 (6,7%), 2 (5%), 2 (4,7%) случаях соответственно.
Синехии при I степени (1-й группа) были представлены фрагментами тонкой соединительной ткани, покрытой эндометрием, с единичными железистыми структурами разной формы и величины, распределенными неравномерно, отдельные железы кистозно расширены (рис. 1а). Синехии при II степени (2-я группа) были представлены волокнистой фиброзной тканью с единичными железистыми структурами, склерозированными кровеносными сосудами, с включением участков мышечной ткани, часто с гиалинозом, покрытой эндометрием (рис. 1б). Синехии при III степени (3-я группа) были представлены грубой фиброзной тканью, часто лишенной железистого компонента, с расстройством кровообращения и распадом, склерозированными сосудами (рис. 1в).
Результаты иммуногистохимического исследования представлены в таблице.
Соотношение экспрессии PgR и ER в железах эндометрия в 1-й группе составило 0,91 (p>0,05), во 2-й группе – 0,62 (p<0,05), в 3-й группе – 1,11 (p>0,05); соотношение экспрессии PgR и ER в строме эндометрия в 1-й группе составило 1,03 (p>0,05), во 2-й группе – 0,99 (p<0,05), в 3-й группе – 1,13 (p>0,05); при норме от 2 до 4.
Соотношение экспрессии PgR и ER в железах внутриматочных синехий в 1-й группе составило 1,09 (p>0,05), во 2-й группе – 0,85 (p<0,05), в 3-й группе – 0,87 (p>0,05); соотношение экспрессии PgR и ER в строме в 1-й группе составило 0,98 (p<0,05), во 2-й группе – 0,92 (p<0,05), в 3-й группе – 0,89 (p<0,05); при норме от 2 до 4.
Таким образом, в проведенном нами исследовании выявлено повышение экспрессии ER в эндометрии и внутриматочных синехиях в пролиферативную фазу менструального цикла при умеренной и средней степени тяжести процесса, а также снижение экспрессии PgR при всех степенях тяжести процесса.
Обсуждение
Полученные анамнестические и клинические данные свидетельствовали об относительной однородности исследуемых групп и были сопоставимы с результатами других авторов [4, 8]. Изучение анамнеза пациенток в нашем исследовании выявило высокую частоту внутриматочных вмешательств в полости матки в основной группе, что подтверждает роль ятрогенного фактора в формировании внутриматочных синехий [2, 4].
Морфологическая характеристика внутриматочных синехий на основании сопоставления гистероскопических данных выявила значительное замещение эндометрия фиброзной тканью у пациенток 3-й группы по сравнению с пациентками 1-й группы.
Понятие «рецептивность эндометрия» стало широко внедряться в научную литературу с 50-х годов прошлого столетия. Различные уровни регуляции этого процесса – генетические, протеомные, гистологические – говорят о его многогранности и подтверждают необходимость комплексной оценки параметров функционирования эндометрия, принимая во внимание влияние патологических процессов на механизмы тонкой настройки [9–11].
ER и PgR, широко представленные на слизистой оболочке тела матки, выполняют важную роль в регуляции функции репродуктивной системы. После связывания рецепторов с эстрогеном и прогестероном происходит активация сигнальных путей для инициации процессов клеточной дифференцировки, столь необходимых для нормального функционирования эндометрия [12]. В проведенном нами исследовании выявлены статистически значимые изменения рецептивности эндометрия у женщин с внутриматочными синехиями 1-й и 2-й группы, которые проявлялись в повышении уровня экспрессии ER, что согласуется с данными Gan и соавт. [13] и снижении уровня экспрессии PgR в ядрах эпителия желез и стромы. Более высокая экспрессия ER в эпителии эндометрия у женщин с внутриматочными синехиями дает основание предполагать более высокую чувствительность этих структур к эстрогенам, возникшую компенсаторно. В то же время более высокая экспрессия рецепторов ER в строме эндометрия женщин с внутриматочными синехиями, по сравнению со стромой эндометрия условно здоровых женщин, обосновывает трофическое паракринное взаимодействие между клетками стромы и эпителия [7].
Низкая экспрессия PgR в эпителии и строме внутриматочных синехий и в эндометрии женщин с внутриматочными синехиями по сравнению с эндометрием условно здоровых женщин объясняет низкую чувствительность к гестагенам. В то же время в нашем исследовании выявлено достоверное снижение экспрессии PgR в эпителии желез и стромы эндометрия у женщин с внутриматочными синехиями при всех степенях тяжести по сравнению с группой контроля, что можно объяснить замещением эндометрия грубой фиброзной тканью, которая является менее активной по сравнению с эндометрием женщин группы сравнения.
При внутриматочных синехиях отмечено наиболее частое их сочетание с хроническим эндометритом, который был выявлен нами в 83,3% случаев. По данным А.В. Шуршалиной [9], при хроническом эндометрите выявлено усиление более чем в 2 раза экспрессии ER и PgR в ядрах клеток железистого эпителия по сравнению с группой контроля (р<0,05); тенденция к усилению экспрессии рецепторов отмечена также в клетках стромы (р>0,05). Эти данные противоречат результатам А.Р. Котикова [14], согласно которым низкая чувствительность эндометрия к прогестерону при хроническом эндометрите является следствием снижения PgR и в меньшей степени ER в ответ на хронический воспалительный процесс в клетках желез и стромы.
В то же время в исследовании В.К. Таболовой [15] при изучении состояния рецепторного статуса эндометрия пациенток с хроническим эндометритом не было выявлено статистически значимых различий между экспрессией ER и PgR в строме и железах у пациенток основной и контрольной групп. Такая неоднородность полученных данных может быть объяснена различным кровотоком в сосудах эндометрия, что было подтверждено в работах Б.И. Железнова [16]. Очаговый фиброз стромы, распространенные склеротические изменения стенок кровеносных сосудов делают эндометрий нереактивным, неполноценным для связывания стероидных гормонов со специфическими рецепторами. Вследствие таких грубых структурных и дистрофических изменений в слизистой оболочке полости матки, преимущественно в строме, у каждой 5-й пациентки с хроническим эндометритом не происходит секреторного превращения эндометрия в виде развития неполноценной стадии секреции. В подтверждение этого в работе Е.Б. Рудаковой [17] была выявлена прямая средневыраженная связь между сохранным кровотоком в сосудах эндометрия и интенсивностью распределения ER и PgR в железах и строме. Кроме того, необходимо иметь в виду, что различная экспрессия ER и PgR в клетках желез и стромы может отражать разные стадии патологического процесса и косвенно характеризовать компенсаторные возможности эндометрия.
Следует отметить, что изменения рецептивности внутриматочных синехий, впервые выявленные в нашем исследовании отдельно от окружающего их эндометрия, позволяют говорить о явлении «мимикрии» – эпителий синехий берет на себя функцию остаточного эндометрия, что проявляется практически схожими уровнями экспрессии, как ER, так и PgR.
Принимая во внимание результаты предыдущих исследований и полученные нами данные, можно заключить, что достоверные изменения рецептивности эндометрия и внутриматочных синехий при I и II степени тяжести процесса, заключающиеся в повышении экспрессии ER, связаны с измененным соотношением стромального и железистого компонентов, что объясняется компенсаторной их реакцией в участках сохраненного эндометрия. Достоверное снижение экспрессии PgR в эндометрии и внутриматочных синехиях при всех степенях тяжести спаечного процесса является следствием угнетения клеток стромы и эпителия, что связано с замещением фиброзной тканью здорового эндометрия.
Таким образом, выявленные изменения рецептивности могут служить предпосылкой для дифференцированного подхода к гормональной терапии у пациенток с внутриматочными синехиями после хирургического адгезиолизиса. В частности, полученные нами данные иммуногистохимического исследования объясняют отсутствие необходимости гормональной терапии в 1-й группе пациенток (при нормальной экспрессии ER). Значительное повышение экспрессии ER во 2-й группе свидетельствует о необходимости гормональной терапии именно при средней степени тяжести процесса с применением более высоких доз эстрогенов. Менее выраженное повышение экспрессии ER в 3-й группе (только в строме самих синехий) обусловлено декомпенсацией репаративных процессов на фоне замещения значительной части эндометрия грубой соединительной тканью и объясняет меньшую эффективность проводимого лечения и более высокую частоту рецидивов.
Выводы
- Нарушения рецептивности эндометрия выявлены при всех степенях тяжести внутриматочных синехий; выраженность этих нарушений усиливается по мере увеличения степени тяжести процесса.
- Нарушения рецептивности проявляются повышением экспрессии ER и понижением экспрессии PgR, как в эндометрии, так и в самих внутриматочных синехиях.
- При I и II степенях тяжести процесса эпителий синехий функционирует как эпителий эндометрия (явление «мимикрии»), выполняя тем самым компенсаторную функцию.
- Значительное повышение экспрессии ER выявлено во 2-й группе (при средней степени тяжести). Менее выраженное повышение экспрессии ER в 3-й группе (только в строме самих синехий) обусловлено декомпенсацией репаративных процессов на фоне замещения значительной части эндометрия грубой соединительной тканью и объясняет меньшую эффективность проводимого лечения и более высокую частоту рецидивов.
