Эндометриоз – гинекологическое, гормонозависимое заболевание, при котором ткань, подобная эндометрию, локализуется в необычных местах, вне матки; встречается у 7–10% женщин репродуктивного возраста [1–4]. Согласно преобладающей в настоящее время точке зрения, эндометриоз является мультифакторным заболеванием, возникновение и развитие которого происходит на фоне нарушения иммунных, гормональных и молекулярно-генетических взаимоотношений в организме женщины. Известно, что пролиферация и рост очагов эндометриоза регулируются женскими стероидными гормонами [2, 5, 6]. Клинически заболевание проявляется болью, хроническим воспалением и бесплодием [7, 8, 9]. В патогенезе эндометриоза расстройства в функционировании иммунной системы признаются важнейшими, поскольку разрастание эндометриоидной ткани за пределами физиологически предназначенной для нее территории возможно лишь при нарушении распознавания нетипичных для нового расположения клеток, их элиминации с новых территорий и разрушения возникающих очагов [8, 10].
Характерным признаком эндометриоза является локальное или системное развитие воспаления как инфекционного генеза – при повреждении и гибели микробных клеток [9, 11], так и стерильного генеза – при повреждении и гибели собственных клеток организма [12]. Ведущую роль в возникновении и развитии воспаления при эндометриозе играют клетки системы врожденного иммунитета: макрофаги, моноциты и нейтрофильные гранулоциты [13]. Нейтрофилы являются одними из главных клеток-эффекторов врожденной иммунной системы, наиболее многочисленными и мобильными клетками среди фагоцитов. Они в числе первых мигрируют в брюшную полость в ответ на присутствие фрагментов ткани эндометрия. Экспериментальные данные, опубликованные в последние годы, уточняют представление о физиологии, метаболизме, эффекторной и регуляторной функциях нейтрофилов, что вызывает большой интерес к изучению их роли в поддержании иммунного гомеостаза, участии в возникновении и развитии острого и хронического воспаления, а также в разрешении этих патологических процессов [8, 14]. Выяснение роли нейтрофилов в возникновении и развитии эндометриоза представляет несомненный интерес, учитывая данные об участии нейтрофилов в воспалительном процессе и о значении воспаления в патогенезе эндометриоза.
Целью настоящего обзора явилось рассмотрение роли нейтрофильных гранулоцитов при формировании воспаления, как одного из ведущих патогенетических механизмов развития эндометриоза.
Расширение представлений об активности и механизмах действия нейтрофилов
В последнее время наши представления о нейтрофилах подверглись существенным изменениям. В течение многих лет считалось, что нейтрофилы являются популяцией однородных, конечно-дифференцированных, высокоподвижных, короткоживущих клеток, разрушающих и элиминирующих патогенные микроорганизмы с помощью цитотоксических механизмов, что сопровождается их собственной гибелью в результате апоптоза. Интерес к этим клеткам возродило появление данных о том, что, в зависимости от степени зрелости или фенотипических особенностей, нейтрофильные гранулоциты могут выполнять, кроме эффекторной, другие важные функции: способствовать развитию врожденного и адаптивного иммунного ответа или формированию толерантности к специфическому антигену [15, 16]. Популяция этих клеток, наряду со зрелыми сегментоядерными формами, включает незрелые, имеющие нефрагментированное ядро, которые способны выполнять не эффекторные, а регуляторные функции. Выделяют гетерогенную популяцию незрелых клеток миелоидного происхождения (MDSC), которая может проявлять регуляторные функции, активируя или подавляя не только врожденный, но и адаптивный иммунные ответы, обладая также ангиогенными свойствами.
MDSC играют важную роль в подавлении иммунных ответов хозяина с помощью таких механизмов, как продуцирование аргиназы-1, высвобождение активных форм кислорода (АФК) и оксида азота и секреция иммуносупрессивных цитокинов, что обусловливает способность ингибировать пролиферацию и цитотоксичность Т-клеток, индукцию увеличения содержания регуляторных Т-клеток и блокирование активации NK-клеток. Фенотипически различают 2 субпопуляции MDSC: CD14-CD15+-гранулоцитарную (G-MDSC) и CD14+CD15−-моноцитарную (M-MDSC) [17]. Эти субпопуляции отличаются по активности, тканевому распределению, морфологии и поверхностным маркерам.
MDSC редко обнаруживаются в периферической крови здоровых взрослых, так как дифференцируются в гранулоциты, макрофаги и дендритные клетки в костном мозге. Однако при онкологических, инфекционно-воспалительных, аутоиммунных заболеваниях в результате изменения дифференцировки этих клеток происходит накопление циркулирующих супрессорных MDSC [18]. Показано значительное увеличение содержания MDSCs в периферической крови пациенток с эндометриозом и в перитонеальной полости мышей с хирургически индуцированным эндометриозом [19]. Большинство MDSC были гранулоцитами, продуцировали АФК и аргиназу, угнетали пролиферацию Тклеток. Сокращение количества MDSCs предотвращало прогрессирование эндометриоза [20].
Проведенные в последние годы исследования, посвященные изучению активности гранулоцитарных нейтрофилов, в корне изменили представления об этих клетках. Существование множества фенотипов нейтрофилов, обладающих различными рецепторами, определяет их функциональные возможности. Наличие большого количества высокочувствительных мембранных поверхностных структур делает возможными функциональную направленность нейтрофилов и мгновенную перестройку этих клеток в зависимости от инициирующего сигнала [21]. Наряду с классическими видами функциональной активности нейтрофилов (быстрое выявление и уничтожение патогенных возбудителей; адгезия на поверхности эндотелия; хемотаксис; «дыхательный взрыв» как основной источник АФК; секреция протеолитических ферментов, цитотоксических белков и пептидов; фагоцитоз фрагментов разрушенных макромолекул) описаны механизмы, связанные с новыми типами рецепторов, распознающих патогенные бактериальные структуры (Toll-подобные рецепторы – TLRs), с образованием нейтрофильных внеклеточных ловушек (Neutrophil Extracellular Trap, NET’s), взаимодействующих между собой и формирующих внеклеточные сети [22, 23]. При связывании TLRs со специфическими лигандами происходит активация нейтрофилов, замедляется их апоптоз и индуцируется секреция цитокинов.
NET’s – новый тип программируемой гибели нейтрофилов – нетоз, осуществляемый на основе секреции клетками ДНК гистонов и цитотоксических компонентов гранул. В процессе нетоза формируются сетевые структуры из ядерного хроматина и гранул антимикробных протеинов, распознающие и разрушающие не только патогенные микроорганизмы, но и компоненты собственных тканей и клеток организма. NET’s увеличивают высвобождение бактерицидных, иммуностимулирующих протеинов и аутоантигенов плазмацитоидными дендритными клетками. Такие ловушки были обнаружены в перитонеальной жидкости и в тканях у женщин с эндометриозом [24]. Количественная оценка NET’s показала значительно более высокое содержание их при эндометриозе, по сравнению с контролем.
Нейтрофилы, активно участвуя в возникновении и развитии острого и хронического воспаления, а также в разрешении этих патологических процессов, синтезируют и выделяют разнообразные про- и противовоспалительные цитокины, факторы роста и некроза клеток. При этом нейтрофилы взаимодействуют с другими клетками системы врожденного иммунитета (моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, клетками с естественной киллерной активностью, или NK-клетками), с клетками адаптивного иммунитета (Т- и В-лимфоцитами), а также с тромбоцитами [4, 7, 8].
Таким образом, продемонстрированы принципиально новые данные о продолжительности существования и дифференцировке нейтрофилов на субпопуляции, обладающие разной функциональной активностью. Наличие различных субпопуляций нейтрофилов, экспрессирующих обширный арсенал рецепторов и продуцирующих широкий спектр цитокинов, хемокинов и ростовых факторов, секретируемых конститутивно и при активации, свидетельствует не только об их важной роли в развитии воспаления, но также о потенциально новых терапевтических мишенях [25]. Представленные данные расширяют и дополняют классические представления о цитотоксической активности нейтрофилов, имеющих непосредственное отношение к эндометриозу и различным гипотезам, предложенным для объяснения его патогенеза, включая «микробиологическую гипотезу» [9].
Нейтрофилы и воспаление
Уникальная роль нейтрофилов состоит в их быстрой миграции и аккумуляции в большом количестве в пораженных местах. Этому способствуют их небольшие размеры и поддержание постоянно большого количества в крови в результате динамического освобождения из костного мозга, а также из маргинальных (пристеночных) пулов для восполнения рекрутирования нейтрофилов в ткани. Маргинальные пулы состоят из нейтрофилов с особыми, специфическими функциями, например, с участием в бактериальном или стерильном воспалении, для поддержания тканевого гомеостаза, репарации пораженных тканей.
Немедленный ответ на патогены или повреждающее воздействие зависит от наличия предактивированных (праймированных) нейтрофилов. Под процессом праймирования нейтрофилов понимают переход этих клеток под влиянием праймирующего стимула из состояния «покоя», или метаболической инертности, в состояние предактивации, связанное с перестройкой метаболизма, энергетического обмена, экспрессией разнообразных белков как в цитоплазме, так и на плазматической мембране в результате активации определенных групп генов. Праймированные нейтрофилы не образуют реактивных радикалов кислорода, они циркулируют с током крови и способны взаимодействовать с различными типами клеток, включая эндотелиальный слой. Последующее добавление разрешающего стимула сопровождается резким усилением различных ответов нейтрофилов, в том числе образованием радикалов кислорода, которое носит синергетический характер. Следует отметить, что многие стимулирующие агенты способны праймировать нейтрофилы в концентрациях или дозах, которые на порядки ниже стимулирующих значений. Природа праймирующего агента и последующего стимулятора может быть совершенно разной. Ответы праймированных нейтрофилов на стимулятор носят немедленный характер, что позволяет таким клеткам оперативно реагировать на возмущающее воздействие, особенно если оно вызывает патогенное или цитотоксическое действие. В качестве праймирующих стимулов часто выступают формилпептиды, липополисахариды (LPS), митохондриальные формилпептиды, фрагменты ДНК органелл, консервативные компоненты цитоплазмы, которые освобождаются при повреждении/гибели клеток [26, 27].
Начальным этапом воспаления является инфильтрация лейкоцитами пострадавшей ткани. Этот процесс запускается веществами, которые освобождаются при повреждении/гибели микробных или эндогенных клеток организма. При инфекционном воспалении на фагоциты крови действуют молекулярные структуры, ассоциированные с патогеном, так называемые паттерны (Patogen Associated Molecular Patternes – PAMPs), при стерильном воспалении – молекулярные структуры (паттерны), ассоциированные с повреждением клеток организма (Damage Assоciated Molecular Patterns –DAMPs). Важно отметить, что и те и другие структуры выступают в качестве сигналов опасности для организма. Такие сигналы распознаются клеточными рецепторами, что сопровождается активацией внутриклеточных сигнальных каскадов, мишенями действия которых являются ядерные рецепторы и ДНК.
Новые типы рецепторов, распознающих консервативные молекулярные структуры PAMPs и DAMPs, получили наименование паттерн-распознающих рецепторов (Pattern Recognition Receptors – PRRs). К таким рецепторам относится семейство TLRs, в настоящее время известно 11 видов (TLR1-TLR11). Эти рецепторы экспрессируются в плазматических мембранах нейтрофилов и в мембранах цитоплазмы. В отличие от иммуноглобулиновых рецепторов лимфоцитов, узнающих отдельные антигенные детерминанты, рецепторы PRRs взаимодействуют c паттернами микроорганизмов или поврежденных собственных клеток. Другое отличие связано с одновременным присутствием всех видов мембранных TLRs в плазматической мембране одного нейтрофила или всех видов цитоплазматических TLRs в этом нейтрофиле, тогда как на плазматической мембране лимфоцита существуют рецепторы только против одной антигенной детерминанты. Такие различия обусловлены необходимостью распознавания и уничтожения разных инфекционных возбудителей как можно быстрее, для предупреждения их размножения в геометрической прогрессии; в то время как специфический иммунный ответ лимфоцитов развивается медленно и связан с делением стимулированных клеток, которое достигает своего максимума через 72–144 ч. Часто описанные паттерны праймируют нейтрофилы, которые подвергаются адгезии на эпителиальных клетках микрососудов.
Нейтрофилы, как наиболее подвижные фагоциты, первыми поступают в очаг тканевого поражения. На всех циркулирующих неактивированных нейтрофилах и костномозговых миелоидных клетках экспрессируется CD62L – L-селектин [LAM-1], относящийся к семейству поверхностных селектинов, которые участвуют в «роллинге» нейтрофилов на поверхности эндотелия. При запуске воспалительного процесса в ходе иммунного ответа уровень экспрессии CD62L может меняться. Этот процесс состоит из трех этапов: праймированные нейтрофилы, «катящиеся» (rolling) по эндотелию сосуда, фиксируются на его поверхности в результате лиганд/рецепторного взаимодействия. Формируется «краевое стояние» нейтрофилов, по сути, отражающее наличие праймированных нейтрофилов, способных взаимодействовать со стенкой сосуда. Затем нейтрофилы образуют псевдоподии и проникают через сосудистую стенку по щелям между эндотелиальными клетками с помощью АТФ-зависимого процесса – диапедеза. Во внесосудистой ткани нейтрофилы подвергаются хемотаксису и перемещаются в очаг воспаления по градиенту хемоаттрактанта. В значительной степени от свойств нейтрофилов и их активности на каждом из этих трех этапов зависит возникновение и развитие воспаления, в котором со временем начинают участвовать другие клетки системы врожденного иммунитета – макрофаги, дендритные и NK-клетки [2, 8, 4, 13]. Инициируя защиту и способствуя привлечению других иммунных клеток, нейтрофилы облегчают создание воспалительного микроокружения [28].
Функционирование активированных нейтрофилов происходит путем фагоцитоза, генерации окислительных радикалов, высвобождения гранул и образования нейтрофильных внеклеточных сетей. Нейтрофилы и макрофаги являются ключевыми клетками как врожденного, так и адаптивного иммунитета и играют важную роль в иммунопатогенезе широкого спектра патологий, в том числе при эндометриозе.
Участие нейтрофилов в патогенезе эндометриоза
Среди современных концепций и теорий этиологии и механизмов развития эндометриоза привлекает внимание «гипотеза бактериальной контаминации», предложенная для объяснения возникновения эндометриоза c участием эндотоксина (липополисахарида, LPS), TLR4-рецепторов, внутриклеточного сигнального каскада и ядерного фактора транскрипции генов – NF-kB, контролирующих рост эндометрия [9]. Результаты исследований Khan Kh. N. et al. (2018) показали, что значительное количество LPS присутствует в перитонеальной жидкости при обратном заносе (рефлюксе) менструальной крови. Продукты распада эритроцитов и LPS участвуют в развитии воспаления в малом тазу. При эндометриозе имеет место взаимодействие между развитием воспаления, образованием регуляторных стероидов в яичниках, синтезом провоспалительных цитокинов разными клетками, включая нейтрофилы, а также комплексными ответными реакциями на стрессорные воздействия, которые непрерывно происходят в пораженных участках, включая весь объем малого таза. Такие реакции способны вызывать дальнейшее развитие эндометриоза. В качестве стандартного медиатора воспаления часто выступает и используется LPS, который является одним из первичных триггеров, освобождаемым при гибели грамотрицательных бактерий во внутриматочной среде, и эффективным регулятором роста эндометрия. LPS может действовать сам по себе или в комбинации с другими агентами, включая стероиды яичников или структуры, образуемые при разных видах стрессов в пораженных тканях.
Важным следствием «гипотезы бактериальной контаминации» при эндометриозе является необходимость учитывать использование антибиотиков у женщин с эндометриозом, которые в первую очередь разрушают бактериальные клетки (бактериолитические антибиотики) и способствуют освобождению больших количеств LPS. В результате ткань (кровь) становится стерильной, а количество свободного LPS увеличивается на порядки. При высокой вариабельности О-антигенных свойств эндотоксинов эффективные иммунные средства защиты от их действия на клетки в настоящее время отсутствуют.
Патогенез эндометриоза является многофакторным, но эндогенные и экзогенные эстрогены считаются потенциальными модуляторами в патофизиологии и/или патогенезе эндометриоза [29]. Хотя рецепторы к эстрогену (и ERα, и ERβ) присутствуют в эндометриальных железах и строме, ERα, вероятно, является основным медиатором эстрогенного действия в этой ткани [30]. Пониженная чувствительность ткани-мишени к биодоступному прогестерону наблюдается у женщин с эндометриозом и, как предполагается, также вносит вклад в патогенез этого заболевания [6, 30].
Поступление нейтрофилов в эндометрий матки и другие ткани при эндометриозе контролируется согласованной активностью двух женских половых стероидов – эстрогена и прогестерона, образующихся в яичниках. Эстроген увеличивает уровень нейтрофилов в пораженных тканях, в то время как действие прогестерона способно как усиливать поток нейтрофилов, так и ослаблять этот процесс, вызывая снижение количества клеток в зависимости от условий микроокружения. Такая регуляция потоков нейтрофилов влияет на характер иммунных реакций и на имплантацию клеток эндометрия. Наличие рецепторов к прогестерону (PR) на нейтрофилах влияет на развитие воспалительного ответа при одновременном присутствии эстрогена и прогестерона. В отсутствие PR нейтрофилы, рекрутированные эстрогенами, подвергались дегрануляции. При исследовании раннего этапа развития эндометриоза на мышиной модели и его зависимости от эстрадиола была найдена существенная инфильтрация брюшной полости нейтрофилами и макрофагами и показано, что эстрадиол и ЕRα играют минорную роль в раннем развитии повреждений. Представлены доказательства того, что ранняя инициация эндометриоза преимущественно зависит от иммунной системы, тогда как эстрадиол/ERα/интерлейкин-6-обусловленные эффекты играют частичную роль в течение 72 ч от трансплантации ткани эндометрия [31]. Эти данные показывают, что существуют две фазы эндометриоза – иммунозависимая и гормонозависимая, и что воздействие на врожденную иммунную систему может предотвратить прикрепление фрагментов эндометрия и развитие очагов эндометриоза в восприимчивой популяции женщин.
Для выяснения роли нейтрофилов на начальном этапе развития эндометриоза в эксперименте с использованием мышиной модели в динамике изучалась зависимость развития эндометриоидных гетеротопий от количества нейтрофилов [32]. Самкам мышей BALB/с, подвергнутым овариэктомии, с 8-недельного возраста вводили эстрадиол, а затем инъецировали фрагменты эндометрия (день 0). Количество нейтрофилов снижали с помощью антинейтрофильных антител либо на ранней (1–3-й день), либо на более поздней стадии (8–12-й день). Контрольным мышам не вводили антитела. На 14-й день определяли количество нейтрофилов в перитонеальной жидкости и взвешивали эндометриоидные поражения. Установлено, что число участков, пораженных эндометриозом, было значительно меньше после введения антител против нейтрофилов на ранней стадии по сравнению с введением на поздней стадии и в контрольной группе. Вес пораженных участков не отличался во всех трех группах. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что нейтрофилы играют критическую роль на начальной стадии формирования эндометриоза.
Увеличение количества нейтрофилов наблюдается в участках, пораженных эндометриозом, и в перитонеальной жидкости [8, 32, 33, 34]. Содержание нейтрофилов в очагах поражения возрастает по мере развития эндометриоза [35]. Авторы считают, что повышенное отношение нейтрофилов к лимфоцитам может быть ценным показателем при диагностике эндометриоза III и IV стадий для пациентов с отрицательным CA-125 сыворотки.
С помощью иммунохимического окрашивания в разные дни после трансплантации ткани матки в брюшную полость овариэктомированных мышей, которым вводили эстроген, определяли пролиферацию клеток, ангиогенез и природу инфильтрированных иммунных клеток в эктопической ткани [36]. Бромдезоксиуридин-позитивные клетки были обнаружены на 4–7-й день после трансплантации в кровеносных сосудах эктопической ткани, что свидетельствует о начале ангиогенеза. В эктопической ткани контрольной группы мышей, которым не вводили исследуемый гормон, процесс ангиогенеза также наблюдался, но в меньшей степени. Глубокая инфильтрация нейтрофилов происходила на 1–4-й день, когда количество нейтрофилов, а также уровень провоспалительного белка MIP-1a и хемокинов в перитонеальной жидкости достигали своего максимума. В опытах in vitro было показано, что перитонеальные нейтрофилы и макрофаги секретировали фактор роста эндотелия сосудов на фоне образования фактора некроза опухоли альфа и интерлейкина6 [36]. Нейтрофилы влияют на железистые и стромальные клетки эндометрия, усиливая их рост и деление при развитии эндометриоза. Избыточное накопление клеток эндометрия в необычном месте расположения, а также рост и пролиферация этих клеток требуют дополнительного поступления питательных веществ и кислорода, что приводит к локальной ишемии и индукции ангиогенеза в пораженном месте.
Важно отметить влияние на ангиогенез и других цитокинов, в частности интерлейкина-8, который образуется в нейтрофилах, индуцируя хемотаксис как нейтрофилов, так и других фагоцитов в пораженную область. Увеличение уровня интерлейкина-8 в перитонеальной жидкости и в сыворотке коррелирует с тяжестью эндометриоза, размером и количеством зон поражения. Помимо этого, уровень интерлейкина-8 влияет на адгезию, инвазию и имплантацию эктопической ткани, а также на интенсивность воспаления [37], усиливая пролиферацию клеток эндометриоидной ткани и подавляя их апоптоз [38, 39]. Фактор аутокринного роста в эндометрии способствует прикреплению эндометриальных клеток и, как следствие, может привести к переходу из острой стадии в стадию хронического воспаления.
В недавно выполненном исследовании также показано, что нейтрофилы и макрофаги могут стимулировать ангиогенез, причем истощение нейтрофилов с помощью антител на ранней стадии эндометриоза изменяло системное и перитонеальное иммунное микроокружение в очагах эндометриоза, о чем свидетельствовали изменения в провоспалительных и ангиогенных медиаторах. Причем снижение уровня нейтрофилов с помощью антител уменьшало количество эндометриоидных поражений и степень их выраженности; при этом истощение нейтрофилов in vivo изменяет системное и перитонеальное иммунное микроокружение мышей [32, 40].
Таким образом, нейтрофилы, как и макрофаги, могут стимулировать ангиогенез на ранней стадии развития эндометриоза; при этом хемокины и цитокины усиливают ангиогенный сигнал для роста эндометриоидной ткани. В связи с тем что ангиогенез играет важную роль в развитии эндометриоза, высказано предположение о возможности тормозить эту патологию, воздействуя на уровень ангиогенных факторов и активность продуцирующих их клеток, в частности, нейтрофилов [40].
Заключение
Клетки системы врожденного иммунитета играют одну из центральных ролей в защите организма от неблагоприятных воздействий. Изучение активности гранулоцитарных нейтрофилов существенно изменило представление об этих клетках. В последние годы значительно продвинулось понимание роли нейтрофилов в возникновении, развитии и разрешении острого и хронического воспаления, иммунорегуляции и патологии ряда заболеваний.
Нейтрофильные гранулоциты при взаимодействии с другими клетками систем врожденного и адаптивного иммунитета активно участвуют в формировании воспаления, одного из ведущих патогенетических механизмов развития эндометриоза, синтезируя и выделяя разнообразные про- и противовоспалительные цитокины, факторы роста и гибели клеток. Существование множества фенотипов нейтрофилов, обладающих различными рецепторами, определяет их функциональные возможности, как эффекторные, так и регуляторные, благодаря чему они могут оказывать активирующее или ингибирующее влияние.
Наличие различных субпопуляций нейтрофилов, экспрессирующих широкий спектр рецепторов и продуцирующих большое количество цитокинов, хемокинов и ростовых факторов, секретируемых при активации, свидетельствует не только об их важной роли в развитии воспаления, но также о наличии потенциальных мишеней для терапевтического воздействия при эндометриозе.
