Среди причин самопроизвольных выкидышей ранних сроков одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [1]. В большом систематическом обзоре была показана роль цитомегаловирусной инфекции и вируса гриппа в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков, в то время как данные о значении папилломавирусной инфекции, парвовируса B19 и вируса простого герпеса остаются противоречивыми [2]. В то же время не у всех пациенток с вышеуказанными вирусными инфекциями происходит прерывание беременности, что свидетельствует о роли иммунной системы в патогенезе невынашивания.
Известно, что рецепторы клеток системы врожденного иммунитета первыми распознают консервативные структуры вирусов, бактерий, грибов и простейших, индуцируя запуск иммунного ответа, в том числе активируя клетки приобретенного иммунитета (Т- и В-лимфоциты) [3–6]. К рецепторам, распознающим чужеродную ДНК, в том числе вирусного происхождения, относится Толл-подобный рецептор (TLR) 9, расположенный на эндосомах, а также цитозольные рецепторы IFI16 и AIM2. Рецепторами, распознающими вирусную РНК, являются TLR3 (лиганд-двухцепочечная вирусная РНК), TLR7 и TLR8 (лиганд-одноцепочечная вирусная РНК). Кроме того, двухцепочечную вирусную РНК распознает также рецептор RIG-I.
Существуют единичные работы, посвященные роли TLR, активируемых вирусными лигандами, в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков [7–10]. Однако в литературе практически отсутствуют исследования, посвященные особенностям экспрессии других внутриклеточных рецепторов, способных распознавать вирусную ДНК и РНК – AIM2, IFI16 и RIG-I.
AIM2, IFI16, RIG-I представляют собой внутриклеточные рецепторы, распознающие нуклеиновые кислоты вирусов, а также собственную ДНК в случае ее деградации [11] (рисунок).
Присутствие ДНК в цитоплазме клетки стимулирует рецептор AIM2. Это приводит к формированию активной инфламмосомы при участии белка ASC и каспазы-1. Инфламмосома способствует переходу интерлейкина-1b (IL-1b) в активную форму и запуску воспалительного каскада. Отличительной особенностью всех инфламмосом является их способность существовать даже после того, как воздействие причины, вызвавшей ее формирование, прекращается. Это способствует длительному существованию воспалительного процесса.
Белок IFI16 также способен распознавать ДНК в цитоплазме клетки с последующим формированием инфламмосомы. Кроме того, он индуцирует синтез интерферонов I типа (интерферон-α и интерферон-β) путем активации белков: стимулятора генов интерферонов (stimulator of interferon genes, STING) и TBK-1. RIG-I распознает двухцепочечную вирусную РНК и запускает синтез интерферонов I типа через TBK-1.
Целью работы было установить особенности экспрессии в децидуальной ткани мРНК внутриклеточных рецепторов RIG-I, IFI16 и AIM2, распознающих ДНК и РНК вирусов, а также белков их сигнальных путей у пациенток с неразвивающейся беременностью и самопроизвольными выкидышами ранних сроков.
Материал и методы исследования
Были обследованы 68 пациенток со спорадическими выкидышами: 34 женщины с неразвивающейся беременностью и 34 – с самопроизвольными выкидышами на сроке 6–10 недель беременности. Контрольную группу составили 57 пациенток, которым был проведен медицинский аборт на том же сроке беременности. Из исследования были исключены пациентки, имеющие тяжелые экстрагенитальные заболевания, антифосфолипидный синдром, эндокринные причины невынашивания беременности, подтвержденные хромосомные аномалии плода.
Материалом являлась децидуальная ткань, которую получали во время выскабливания полости матки. Характер ткани был подтвержден гистологически. Полученную децидуальную ткань помещали в консервирующий раствор RNAlater (Ambion, США). Экстракцию РНК и обратную транскрипцию проводили с помощью методов, описанных ранее [10].
Исследование экспрессии мРНК RIG-I, IFI16 и AIM2, а также белков их сигнальных путей (ASC, TBK1, STING, IL-1b и каспазы-1) проводили c помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно рекомендациям MIQE [12]. Подбор праймеров генов осуществлялся с помощью базы данных BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Для ПЦР в режиме реального времени использовали смесь qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). В качестве генов-нормировщиков были выбраны наиболее стабильно экспрессируемые – пептидилпролилизомераза A (PPIA) и b-актин.
Амплификацию проводили на амплификаторе CFX96 (Biorad, США) по методике, описанной ранее [10]. Последовательность праймеров и температура отжига указаны в табл. 1.
Полученные результаты выражали в относительных единицах (отн. ед.), вычисляя их по формуле: R = 2 – (Cq target – (Cq ref1+Cqref2)/2)), где R – нормализованная экспрессия мРНК исследованных генов, Cq target – Cq исследованного гена, Cq ref – Cq генов-нормировщиков [13].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 13.1 (Statsoft, США). Нормальность распределения определяли с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Для определения достоверности различий признаков, имеющих нормальное распределение, использовали критерий Стьюдента для двух независимых выборок, результаты представляли как M±m. При отсутствии нормального распределения достоверность различий оценивали с помощью критерия Манна–Уитни, результаты представляли как медиану (нижний квартиль; верхний квартиль). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Были проанализированы клинические и анамнестические данные беременных: возраст, социальноэкономическое положение, профессиональные вредности, характер менструальной функции, репродуктивный анамнез, морфометрические показатели.
Не было выявлено достоверных различий в возрасте и сроке беременности у пациенток всех исследуемых групп. Средний возраст пациенток с неразвивающейся беременностью составил 27,88±2,31 года, женщин с самопроизвольными выкидышами – 27,05±2,01 года, пациенток контрольной группы – 26,46±1,98 года. Все женщины являлись жительницами города Белгорода, имели среднее и высшее образование. Профессиональные вредности при сборе анамнеза выявлены не были. Не было установлено достоверных различий в возрасте менархе и продолжительности менструального цикла. Количество беременностей и родов у пациенток всех исследуемых групп достоверно не отличалось. Однако количество выкидышей в анамнезе было достоверно выше как у пациенток с неразвивающейся беременностью (0,72±0,48), так и у пациенток с самопроизвольными выкидышами (0,81±0,59) по сравнению с контрольной группой (0,20±0,16) (p<0,05).
При анализе морфометрических показателей (рост, вес, индекс массы тела) достоверных различий между исследуемыми группами выявлено не было.
У пациенток с неразвивающейся беременностью наблюдалось семикратное увеличение экспрессии мРНК рецептора AIM2 по сравнению с группой контроля, что сопровождалось увеличением экспрессии каспазы-1 и IL-1β (табл. 2). Экспрессия мРНК RIG-I и IFI16, а также белков их сигнальных путей в децидуальной ткани пациенток с неразвивающейся беременностью не имела достоверных различий с группой контроля.
AIM2 является цитоплазматическим рецептором, который распознает ДНК вирусов, а также ДНК листерий – бактерий, персистирующих внутри клетки [14, 15]. Связывание AIM2 с соответствующими лигандами приводит к формированию инфламмосомы и активации каспазы-1 [16]. В свою очередь, активация каспазы-1 приводит к увеличению IL-1β и запуску воспалительного ответа. IL-1β активирует клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, макрофаги, натуральные киллеры), а также Th17-лимфоциты, обладающие цитотоксическим действием [17]. Еще одним свойством каспазы-1 является способность индуцировать клеточную гибель путем пироптоза [18]. По-видимому, данный механизм реализуется при неразвивающейся беременности.
У пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков не было выявлено достоверных различий в экспрессии мРНК AIM-2, IFI16, RIG-I и белков их сигнальных путей. Это свидетельствует о том, что эти рецепторы не играют роли в патогенезе данного осложнения.
Заключение
Таким образом, у пациенток с неразвивающейся беременностью в децидуальной ткани происходит увеличение экспрессии мРНК белка AIM2, распознающего внутриклеточную ДНК вирусов и листерий. Это сопровождается увеличением экспрессии мРНК каспазы-1 и IL-1β, способствующих индукции воспалительной реакции и клеточной гибели путем пироптоза.
У пациенток с самопроизвольными выкидышами не наблюдается увеличения экспрессии мРНК AIM2, RIG-I, IFI16 и белков их сигнальных путей, что свидетельствует о том, что данные рецепторы не играют существенной роли в их патогенезе.
