Бесплодие у супружеской пары остается одной из важных медицинских и социальных проблем. На долю женского бесплодия в Российской Федерации приходится около 50%, мужского – 20–30%, сочетание женского и мужского фактора бесплодия встречается в 20% [1]. Несмотря на оптимизацию протоколов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), их эффективность за последние годы значительно не меняется и остается на уровне 30–40% [2]. Поэтому актуальной является разработка новых методических подходов как для понимания причин бесплодия, так и для диагностических и прогностических целей.
Как известно, успех в программах ВРТ зависит от трех факторов: качества гамет, определяемого состоянием репродуктивной системы обоих партнеров, качества эмбриона, функциональной зрелости (рецептивности) эндометрия [3]. Эндометрий максимально восприимчив к имплантации эмбриона на стадии бластоцисты в период «имплантационного окна». Совокупность структурно-функциональных характеристик слизистой тела матки, обеспечивающих оптимальные условия для имплантации бластоцисты, определяют как рецептивность эндометрия. Имплантация зависит от сложной системы регуляции межмолекулярных и межклеточных взаимодействий, обеспечивающих «диалог» между эмбрионом и рецептивным эндометрием, а также дальнейшего проникновения эмбриона в децидуальный слой матки с последующей дифференцировкой клеток эмбрио- и трофобласта [4].
Одной из основных причин нарушения механизмов имплантации является смещение «имплантационного окна». У большинства женщин «имплантационное окно» охватывает 6–10-й день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) в секреторную фазу менструального цикла. Однако в некоторых случаях «имплантационное окно» смещается в силу индивидуальных особенностей или под влиянием гормональной стимуляции [5]. При различных патологиях эндометрия наблюдается дисрегуляция его секреторной трансформации, происходит спад активности маточных желез, в частности, секрета эндометрия, что является причиной снижения рецептивности и, как следствие, нарушения взаимодействия эмбриона с материнским организмом в доимплантационный период [6].
Общеизвестными методами оценки рецептивности эндометрия являются: гистологический анализ [7], электронная микроскопия [8], иммуногистохимическое исследование [9], определение уровня простагландинов с помощью масс-спектрометрии [10], молекулярно-генетический анализ [11].
Данные методы являются крайне зависимыми от сопутствующих факторов, а молекулярные механизмы имплантации остаются в значительной степени неясными. Это дало стимул для дальнейших исследований и поиска нового маркера рецептивности эндометрия.
В настоящее время активно изучается роль омиксных высокопроизводительных технологий [12–16], в частности, малых некодирующих РНК (мнкРНК), среди которых наибольший интерес представляют микроРНК (miRNAs) и пивиРНК (piwiRNAs). МикроРНК представляют собой одноцепочечные молекулы РНК длиной от 22 до 24 нуклеотидов. Основная их функция заключается в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне путем образования комплементарных/полукомплементарных структур с 3’-нетранслируемой областью (3’UTR) целевой матричной РНК (мРНК) в составе РНК-индуцированного комплекса сайленсинга (RISC), что приводит к эндонуклеазному расщеплению мРНК и/или блокированию синтеза белка при взаимодействии с факторами инициации трансляции [17, 18].
По данным анализа базы miRBase v22 (http://mirbase.org/) у людей идентифицировано 2654 микроРНК, которые играют важную роль во многих биологических процессах. Практически все клетки в организме способны секретировать микроРНК, и уровень их концентрации в биологической среде является отражением как физиологических, так и патологических состояний [19].
Менее изученными представителями класса мнкРНК с точки зрения выполняемой в клетке функции и участия в патологических процессах являются пивиРНК. ПивиРНК представляют собой одноцепочечные молекулы РНК длиной 24–31 нуклеотид, которые специфически связываются с белками piwi подсемейства Argonaute и выполняют в клетке две основные функции: поддержание стабильности генома путем ингибирования экспрессии мобильных участков генома (транспозонов) и регуляция экспрессии кодирующих белок генов за счет РНК-интерференции подобно механизму действия микроРНК [20, 21].
В последние годы активно изучаются преимущества мнкРНК в качестве диагностических и прогностических биомаркеров исходов программ ВРТ в исследованиях имплантационного потенциала эмбриона и оценки рецептивности эндометрия [22–25].
Жизнеспособность эмбриона является одним из ключевых факторов, определяющих имплантацию. Оценка качества эмбрионов, согласно морфокинетическим критериям, включает в себя деление клеток, скорость развития эмбриона, форму бластомеров и степень их фрагментации. Секретируемые в среду культивирования мнкРНК в процессе имплантации эмбрионов могут быть использованы в качестве неинвазивных маркеров качества эмбрионов [26]. Так, Rosenbluth E. et al. [27] провели количественную оценку микроРНК в культуральной среде методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и обнаружили специфичные для эмбриона miR-191 и miR-372. В случае анеуплоидии эмбрионов плохого качества уровень miR-191 в среде культивирования был резко повышен и ассоциирован с отрицательными исходами в программах ВРТ. Также была обнаружена корреляция уровня miR-372 с отрицательным исходом программы ВРТ, но связь с хромосомным набором и качеством эмбриона не была установлена. В свою очередь, Cuman C. et al. [28] показали, что уровень экспрессии микроРНК может быть связан как с имплантационным потенциалом самого эмбриона, так и с рецептивностью. Уровень miR-661 был повышен у эмбрионов с отсутствием имплантационного потенциала по сравнению с бластоцистами, способными к имплантации. Результаты исследования показали наличие транспорта miR-661 в комплексе с белком Argonaute 1 из среды культивирования бластоцисты внутрь клеток первичной культуры эндометрия. Повышенный уровень секреции miR-661 негативным образом влияет на адгезию клеток трофобласта к эпителию эндометрия, что приводит к нарушению имплантации эмбриона.
Возможность использования анализа уровня экспрессии микроРНК для оценки имплантационного потенциала эмбриона в среде культивирования была продемонстрирована Borges E. et al. [29]. По результатам тестирования семи микроРНК статистически значимые различия групп с отрицательным и положительным результатами ВРТ были выявлены по уровню экспрессии miR-142-3p (p<0,001). Авторы исследования приходят к выводу о том, что miR-142-3p может быть использована в качестве маркера имплантационного потенциала бластоцисты.
Несмотря на многочисленные исследования зарубежных коллег, роль пивиРНК в культуральной среде эмбрионов не была изучена. Исходя из этого в 2020 г. Timofeeva A. et al. [30] впервые опубликовали крупное исследование о роли ключевых молекул микроРНК и пивиРНК, которые участвуют в процессе формировании здорового эмбриона и его имплантационного потенциала. Было произведено глубокое секвенирование мнкРНК в образцах культуральной среды эмбрионов с последующей количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Доказано, что уровни секреции таких микроРНК и пивиРНК, как hsa_piR_011291, hsa_piR_019122, hsa_piR_001311, hsa_piR_015026, hsa_piR_015462, hsa_piR_016735, hsa_piR_019675, hsa_piR_020381, hsa_piR_020485, hsa_piR_004880, hsa_piR_000807, hsa-let-7b-5p и hsa-let-7i-5p, являются отражением качества эмбрионов на стадии морулы. Дисбаланс регуляции уровня экспрессии данных молекул на стадии морулы приводит к образованию бластоцисты низкого качества или даже к остановке ее развития либо деградации. Повышение уровня экспрессии мнкРНК эмбрионом до определенных значений на стадии морулы является отражением качества материнско-зиготического перехода, который необходим для эмбриогенеза и наступления беременности.
Однако на успешное наступление беременности влияют не только качество и имплантационный потенциал самого эмбриона, но и рецептивность эндометрия [31].В работе Viella F. et al. [32] оценивали роль экспрессии микроРНК в клетках эндометрия как посттранскрипционного регулятора имплантации эмбрионов. Для того чтобы определить рецептивность эндометрия и подходящий день для переноса эмбрионов, авторы сравнивали экспрессию микроРНК в разные фазы цикла. Полученные образцы были разделены на следующие группы: ранняя пролиферативная (РП; 6–8-й дни; n=4), поздняя пролиферативная (ПП; 9–14-й дни; n=4), ранняя секреторная (РС; 15–18-й дни; n=4), «имплантационное окно» (19–23-й дни; n=4) и поздняя секреторная (ПС; 24–28-й дни; n=4). Методом микроматричного анализа были идентифицированы микроРНК в маточном аспирате. Выявлена их дифференциальная экспрессия между фазами менструального цикла. Выраженные изменения уровня экспрессии микроРНК в маточном аспирате обнаружены как в секреторную фазу, так и в пролиферативную фазу менструального цикла относительно окна имплантации. Cтоит отметить, что в пролиферативную фазу уровень экспрессии микроРНК был значительно снижен, а в секреторную фазу – повышен. Также наибольшие изменения в экспрессии были выявлены у hsa-miR-30d из семейства miR-30d в «имплантационное окно». Авторы продемонстрировали, что идентифицированная hsa-miR-30d в клетках эндометрия может быть рассмотрена в качестве одного из маркеров рецептивности эндометрия. Более того, при добавлении в культуральную среду miR-30d эмбрионы на этапе до имплантации экспрессируют молекулы адгезии, такие как интегрин бета 3 (ITGB3), интегрин альфа 7 (ITGA7) и кадгерин 5 (CDH5).
Ferlita A. et al. [33] аналогичным образом показали, что экспрессия miR-30d и miR-30b значительно повышена в рецептивном эндометрии (ЛГ+7), а уровень miR-494 снижен по сравнению с пререцептивным эндометрием (ЛГ+2).
В последние годы широко обсуждалась роль некоторых белков в процессе имплантации эмбрионов. Так, например, апикальная поверхность эндометрия покрыта гликокаликсом, который содержит гликопротеиды. Наиболее значимым из семейства адгезивных молекул гликопротеидов является муцин1 (Muc1). Ранее считалось, что экспрессия Muc1 повышается в период «имплантационного окна», что благоприятно влияет на рецептивность эндометрия. Однако, по данным Inyawilert W. et al. [34], выработка Muc1 значительно снизилась во время окна имплантации и могла быть связана с негативной регуляцией miR-199a, let-7a и let-7b. Liang J. et al. [35] в своей работе описали влияние miR-192-5p на экспрессию Muc1 клетками эндометрия. Выяснилось, что высокая экспрессия данных молекул предотвращает адгезию трофобласта в эндометрий и наступление беременности в целом. Исходя из этого авторы отметили, что анализ уровня микроРНК и его локальное влияние на Muc1 могут стать ключевыми факторами в диагностике и лечении бесплодия.
Считается, что связывающий протеин-1 инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-1) продуцируется децидуальными стромальными клетками и стимулирует клеточную миграцию и адгезию в момент максимальной рецептивности эндометрия. Чрезмерное увеличение экспрессии miR-145 снижает уровень IGFBP-1 в эндометрии, тем самым ингибируя инвазию трофобласта [36]. Tochigi H. et al. [37] продемонстрировали, что экспрессия miR-542-3p снижает секрецию таких белков, как IGFBP1, WNT4 (Wnt Family Member 4) и PRL (Prolactin gene), которые играют непосредственную роль в процессе децидуализации стромы эндометрия. Аналогичные исследования проводились учеными разных стран, которые описывали негативное влияние молекулы miR-542-3p на рецептивность эндометрия [38, 39].
Немаловажную роль в процессах пролиферации клеток эндометрия и инвазии бластоцисты играют такие факторы, как интерлейкин (IL)-1β, сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGF), эпидермальный ростовой фактор (EGF), фактор роста фибробластов (FGF1), фактор ингибирования лейкемии (LIF) и т.д. Наиболее значимым фактором регуляции ангиогенеза и наиболее экспрессируемым в эндометрии человека является VEGF. Низкие уровни VEGF снижают маточный кровоток, что может приводить к развитию «тонкого» эндометрия, не способного к нидации эмбриона [40]. В одном из исследований было показано, что miR-184 увеличивает уровень экспрессии VEGF с помощью активации сигнальных путей RAS/RAF/MEK/ERK, что благоприятно сказывается на регуляции процесса васкуляризации ткани эндометрия и имплантации [41]. Также было отмечено, что miR-26a выполняют сложные и разнообразные функции путем воздействия на PTEN и косвенно регулируя сигнальный путь PI3K/AKT в клетках эндометрия, а также контролируют экспрессию остеопонтина (OPN), циклооксигеназы-2 (COX-2), пролактина (PRL) и VEGF в клетках эндометрия [42].
Стоит отметить, что среди активно изучаемых маркеров эндометриальной рецептивности LIF является одним из ключевых. LIF продуцируется эндометрием в течение всего менструального цикла, однако его уровень значительно выше в секреторную фазу цикла. Как известно, LIF запускает активацию сигнального пути STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), который оказывает влияние на морфофункциональное состояние эндометрия и повышает его рецептивность. В свою очередь, бластоциста имеет на своей поверхности специфические LIF-рецепторы: LIF-R и gp130, что свидетельствует о возможном механизме взаимодействия эмбриона и эндометрия [43]. По результатам исследования Dong X. et al. [44], экспрессия miR-223-3p была выше у небеременных мышей по сравнению с беременными (1,09±0,20 против 0,41±0,11, p<0,01). Напротив, экспрессия LIF была ниже у небеременных мышей по сравнению с беременными мышами (1,04±0,34 против 6,03±0,42, p<0,001). Чтобы подтвердить, влияет ли miR-223-3p на образование пиноподий, ассоциированных с увеличением экспрессии LIF, была изучена апикальная поверхность эндометрия методом электронной микроскопии. Было показано, что экспрессия miR-223-3p влияет на имплантацию эмбрионов путем подавления экспрессии LIF и пиноподий в эндометрии у беременных мышей. Увеличение miR-223-3p во время окна имплантации может уменьшить шанс наступления беременности и привести к бесплодию. Поэтому MiR-223-3p может служить потенциальным маркером рецептивности эндометрия.
Кроме того, рецептивность эндометрия определяется активностью половых гормонов, которые могут связываться с рецепторами ткани эндометрия и изменять их морфофункциональные свойства в период «имплантационного окна». В связи с этим изучается роль половых гормонов, влияющих на уровень экспрессии микроРНК в эндометрии. К примеру, прогестерон индуцирует экспрессию miR-125b в клетках эндометрия. В то же время повышенная экспрессия miR-125b уменьшает активность матриксной металлопротеиназы 26 (MMP26), которая участвует в деградации внеклеточного матрикса, тем самым снижая частоту имплантации. Также прогестерон регулирует экспрессию факторов транскрипции генов HOXA10 (Homeobox A10), НОХА11 (Homeobox A11), которые значимо снижены среди женщин с жалобами на бесплодие, привычное невынашивание беременности и эндометриоз [45]. В работе Salmasi S. et al. [46] было показано, что стимуляция яичников и введение экзогенного прогестерона увеличивают плотность CD31-положительных клеток (эндотелиальных клеток) за счет активации белка VEGF, который, в свою очередь, является мощным ангиогенным белком, принимает участие в процессах неоваскуляризации, а при ингибировании его функции может привести к бесплодию.
Akbar R. et al. [47] изучили роль семейства miR-183, а именно miR-183-5p, miR-182-5p и miR-96-5p в имплантации эмбрионов. Продемонстрировано участие miR-183-5р в эстрогензависимой активации эндометриальных клеток, а ее ингибирование значительно снижало частоту имплантации эмбрионов и увеличивало экспрессию CTNNA2 (Catenin Alpha 2). Авторы пришли к выводу, что miR-183-5p и CTNNA2 могут быть потенциальными биомаркерами восприимчивости эндометрия и использованы в качестве диагностических и прогностических методов для успешной имплантации эмбрионов.
Сравнительный анализ уровней экспрессии miR-135b и НОХА10 был проведен в исследовании Riyanti A. et al. [48] методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Экспрессия miR-135b в ткани эндометрия у бесплодных пар оказалась выше в 1,81 раза по сравнению с контрольной группой (p<0,01), тогда как экспрессия HOXA10 была значительно ниже контрольных значений (p=0,047). Была обнаружена существенная отрицательная корреляция между уровнями экспрессии miR-135b и HOXA10 (p=0,021; r= -0,607).
Таким образом, на основании полученных данных целесообразным является изучение мнкРНК в образцах эндометрия и их транскрипционный профиль для определения рецептивности эндометрия.
Посредством детального молекулярного анализа был разработан тест ERA (Endometrial Receptivity Analysis) по оценке уровня экспрессии 238 генов, статистически значимо отличающий рецептивный эндометрий от пре- и пострецептивного эндометрия [49]. На данный момент он является единственным эффективным и внедренным тестом в клиническую практику. Для большинства пациентов тест ERA проводится в цикле заместительной гормональной терапии при помощи пайпель-биопсии на 5-й день после введения прогестерона (П+5), а также в естественном цикле спустя 7 дней с момента пика ЛГ (ЛГ+7). Результат теста показывает состояние эндометрия в день проведения биопсии и дает возможность принять решение об индивидуальном переносе эмбрионов pET (personalized embryo transfer) [50]. Hashimoto T. et al. [51] также доказали эффективность pET у женщин с повторными неудачными попытками переноса эмбрионов. Проведение теста ERA способствовало повышению частоты наступления клинической беременности у женщин с неправильно установленным окном имплантации в предыдущих попытках ЭКО, которая оказалась сравнимо больше при стандартном переносе эмбрионов (50% против 35% соответственно).
В крупном ретроспективном исследовании Patel J. et al. [52] были отобраны 248 пациенток для сравнительного анализа рецептивного и нерецептивного эндометрия. С помощью теста ERA рецептивный эндометрий был выявлен у 82,3% (204/248) пациенток, в то время как нерецептивный эндометрий – у 17,7% (44/248). Авторы считают, что pET с помощью теста ERA поможет определить «имплантационное окно» и улучшить исходы наступления беременности в циклах ВРТ.
Несмотря на большое количество исследований в области поиска потенциальных маркеров рецептивности эндометрия, однозначно идеального фактора, отражающего фертильность, на данный момент не верифицировано. Более того, существующие методы оценки рецептивности эндометрия основаны на инвазивных методах, таких как пайпель-биопсия. В связи с этим целесообразным и актуальным является дальнейший поиск оптимальной панели для неинвазивной диагностики состояния эндометрия и наиболее подходящего дня для переноса эмбрионов. Поэтому Li T. et al. [53] впервые выделили мнкРНК из внеклеточных везикул путем аспирации маточной жидкости у пациенток в естественном цикле и в цикле гормональной терапии. Были идентифицированы 11 микроРНК и 1 пивиРНК, которые могут положительно влиять на рецептивность эндометрия и имплантацию эмбрионов. Целью исследования Grasso A. et al. [54] было изучить и сравнить экспрессию микроРНК эндометрия в секреторную фазу менструального цикла в естественном цикле и цикле заместительной гормональной терапии. Аспирация 10–50 мкл секрета эндометрия проводилась у 40 женщин в естественном цикле ЛГ+0 (n=9), ЛГ+3 (n=9), ЛГ+5 (n=7) и ЛГ+7 (n=2) и в циклах заместительной гормональной терапии: П+0 (n=9), П+1 (n=8), П+3 (n=8) и П+5 (n=6). С помощью количественной ПЦР в реальном времени определяли экспрессию микроРНК в анализируемых группах. Найдены различия в уровне экспрессии hsa-miR-3656, hsa-miR-4516, hsa-miR-3648, hsa-miR-3960, и hsa-miR-5100 при сравнении ЛГ+0 и П+0; hsa-miR-3960 и hsa-miR-3648 при сравнении ЛГ+5 и П+3. Существенной разницы между естественным циклом и циклом с заместительной гормональной терапией по уровню экспрессии анализируемых микроРНК выявлено не было. При этом рецептивная фаза характеризовалась экспрессией hsa-mir-30d-5p и hsa-miR-30b-3p. В случае снижения уровня экспрессии hsa-mir-30d-5p не происходит адгезии бластоцисты к эндометрию и дальнейшей ее инвазии. Авторы пришли к выводу, что снижение уровня экспрессии miR-30b-3p в секрете эндометрия является прогностическим фактором отсутствия имплантации. Секреторная фаза менструального цикла в естественных циклах и в циклах заместительной гормональной терапии не отличается по профилю экспрессии микроРНК.
Заключение
Выявленные многогранные аспекты влияния мнкРНК на межклеточные взаимодействия, возможно, являются важными локальными регуляторными факторами имплантации. Проведенный анализ литературных данных продемонстрировал, что, помимо циклических изменений в морфологии эндометрия, существует очень сложная взаимосвязь между мнкРНК и их многочисленными генами-мишенями, кодирующими белки-маркеры рецептивности эндометрия и имплантационного потенциала эмбрионов.
