С момента рождения первого ребенка (1978), зачатого с помощью технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), прошло уже более 40 лет, с момента внедрения преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) (1989) – более 30 лет. Однако, эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) долгие годы не превышает 30–40% [1]. Известно, что на частоту наступления беременности (ЧНБ) оказывают влияние ряд факторов, ключевой из которых – качество эмбриона, переносимого в полость матки. Оценка качества эмбриона чаще всего проводится на основании морфологических критериев, а также результатов преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А).
Однако данные методы имеют ряд ограничений. Отбор эмбрионов только на основании морфологических критериев не позволяет исключить перенос анеуплоидных эмбрионов. ПГТ – это всегда дорогостоящая, инвазивная методика, также не гарантирующая успешного наступления беременности.
Учитывая описанные ограничения, учеными проводится поиск альтернативных неинвазивных методов оценки эмбриона на преимплантационном этапе. Так, в последние годы, значительный интерес исследователей уделяется изучению отработанной культуральной среды, оценке различных ее составляющих и разработке на их основе новых эффективных методов оценки и отбора наиболее компетентных эмбрионов.
На преимплантационном этапе эмбрион находится в условиях культивирования в питательной среде. Поглощение питательных веществ, присутствующих в среде, а также выделение в нее метаболитов и генетического материала могут являться источником информации с целью оценки жизнеспособности эмбриона. Ученые предполагают, что на основе анализа отработанной культуральной среды можно изучать не только генетический статус эмбриона, но и предсказывать его возможное развитие и будущее здоровье [2]. Оценивают внеклеточную геномную и митохондриальную ДНК, транскриптом (матричные и некодирующие РНК), протеом (структурные и функциональные белки, энзимы) и метаболом (липиды, аминокислоты, карбогидраты, нуклеотиды) [3–6].
Разработка новых неинвазивных методов позволит отбирать эуплоидные эмбрионы с наибольшим потенциалом к имплантации, увеличивая, таким образом, частоту живорождения и сокращая время до наступления беременности.
Преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии и неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии
Проведение ПГТ-А является одним из самых важных этапов программ ВРТ. По данным мета-анализа 2018 г., проведение ПГТ-А в циклах ЭКО значительно увеличивает ЧНБ и частоту родов живым плодом, не оказывая негативного влияния на дальнейший рост и развитие ребенка (оценивались исходы до возраста 9 лет) [7]. Выполнение ПГТ-А не только способствует предотвращению рождения детей с генетической патологией, но и увеличивает частоту имплантации на перенос, снижает риск потери беременности в I триместре, сокращает время до наступления беременности [7–9].
При выполнении ПГТ-А исследуются разные виды биологического материала (полярные тельца, бластомеры, клетки трофэктодермы (ТФЭ)) на разных стадиях развития эмбриона различными диагностическими методами (FISH, ПЦР, NGS, aCGH). Однако данные диагностические методы имеют ряд недостатков: ПГТ на полярных тельцах позволяет получить информацию только о генетическом состоянии ооцитов, а ПГТ на бластомерах (получают 1 клетку на 3–4-е сутки развития) и клетках ТФЭ (получают 3–8 клеток на стадии бластоцисты) имеет ограничение в виде возможного хромосомного мозаицизма эмбрионов (частично преодолеть проблему удается при выполнении биопсии нескольких клеток ТФЭ, в сравнении с биопсией одного бластомера) [10, 11].
Кроме того, проведение инвазивного ПГТ имеет также технические (обученный персонал, специальное оборудование) и этические ограничения [12]. Выполнение анализа чаще всего требует дополнительного времени, сегментации цикла и витрификации эмбрионов.
Детекция внеклеточной геномной и митохондриальной ДНК в отработанной культуральной среде открыла новые перспективы для развития неинвазивных методов диагностики в репродуктивной медицине [13–16]. К настоящему моменту в ряде научных работ уже прослежено возможное проведение неинвазивного ПГТ-А (ни-ПГТ-А). Оценена частота соответствия результатов, полученных при анализе внеклеточной ДНК (вкДНК) отработанной культуральной среды, и результатов оценки ДНК эмбриона при исследовании полярных телец, клеток ТФЭ и всего эмбриона [12].
Источники внеклеточной ДНК
Открытие вкДНК в отработанной культуральной среде поставило перед исследователями вопрос о ее происхождении. Возможными источниками вкДНК рассматривают клетки ТФЭ и внутренней клеточной массы (ВКМ). Механизмы и условия секреции вкДНК в культуральную среду обсуждаются исследователями. Высказываются предположения о выделении вкДНК в процессе апоптоза клеток. Учитывая, что в качестве механизма самокоррекции, апоптозу более подвержены анеуплоидные клетки, ряд исследователей ставит под сомнение ревалентность данных анализа вкДНК отработанной культуральной среды [12, 17, 18]. Chen Y. et al. в исследовании 2021 г. проводили полногеномное метилирование и секвенирование ДНК отработанной культуральной среде. Авторы выделили и показали несколько источников вкДНК: бластоцисты, кумулюсные клетки и полярные тельца. Ученые выделили вкДНК из эпибласта и ТФЭ, различавшихся по профилю метилирования. Указанные данные стали признаком того, что вкДНК может происходить как из ТФЭ, так и ВКМ [19]. В настоящее время появляется все больше научных работ, свидетельствующих о природе происхождения вкДНК не только как результата апоптоза анеуплоидных клеток, но и как отражения ВКМ. Необходимо проведение дополнительных исследований для более полного понимания механизмов высвобождения вкДНК.
Соответствие результатов генетического тестирования на анеуплоидии и неинвазивного преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии
Частота соответствия (concordance rates) результатов ни-ПГТ-А и стандартного ПГТ-А по клеткам ТФЭ по данным литературы варьирует от 33,3 до 89,1% [14, 20–22]. Согласно результатам Rubio C. et al., соответствие результатов оценки вкДНК в сравнении с биопсией ТФЭ по отношению к ДНК ВКМ составляет 87,5 и 84,5%, соответственно [22]. По данным других исследователей, частота ложноположительного результата на анеуплоидии при ни-ПГТ-А значительно ниже, чем при биопсии ТФЭ [12]. Указанные результаты предполагают, что оценка вкДНК может быть более репрезентативной, чем при инвазивных методах ПГТ-А, поскольку в культуральной среде содержится и вкДНК ВКМ эмбриона.
Учитывая высокую актуальность внедрения неинвазивных методов в клиническую практику, исследователями интенсивно ведется разработка стандартизации метода ни-ПГТ-А, проводятся крупные многоцентровые исследования [22]. Так показано, что при соблюдении единой определенной методологии исследования, результаты ни-ПГТ-А не имеют значимых отличий в разных центрах. В одном из самых крупных исследований Rubio C. et al. провели оценку (ПГТ-А и ни-ПГТ-А) 1301 бластоцисты в 8 центрах 4 стран [22]. Частота соответствия результатов инвазивного и неинвазивного ПГТ-А среди разных центров составила от 72,5 до 86,3%, с наивысшими показателями для центров, строго соблюдавших технологию проведения тестирования и меры снижения контаминации культуральной среды. Чувствительность и специфичность достигали 91,3 и 93,3%, соответственно. Мультифакторный анализ не выявил влияние данных анамнеза пациентки, протокола овариальной стимуляции, условий культивирования и качества эмбрионов на точность результатов.
Другие исследователи высказывают сомнения относительно эффективности проведения ни-ПГТ-А [12, 18]. Так, согласно данным проспективного когортного исследования Hanson B.M. et al., включавшего анализ 166 эмбрионов, несоответствие между результатами ПГТ-А и ни-ПГТ-А достигало 40,4%. Кроме того, исходом переносов 3 эмбрионов, которые были классифицированы как анеуплоидные по ни-ПГТ-А, было рождение здоровых новорожденных [23]. Авторы связывают широкую вариабельность эффективности неинвазивной диагностики с множеством различий в дизайне исследований. Одной из основных задач исследователей стал поиск и разработка унифицированной, наиболее эффективной технологии.
Технические аспекты
Показано, что секреция внеклеточной геномной ДНК в культуральную среду является физиологическим феноменом и не зависит от пола эмбриона, его качества, уровня фрагментации, витрификации, выполнения вспомогательного хетчинга или плоидности набора хромосом [12, 13, 24–26]. Пункция полости бластоцисты также не влияет на эффективность детекции и анализа вкДНК [27].
Для анализа вкДНК используют несколько методов: NGS (секвенирование следующего поколения), aCGH (сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах) и метод количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция). NGS и aCGH относятся к полногеномным методам, позволяющим выявлять все виды анеуплоидий и некоторые варианты хромосомных аберраций. Метод количественной ПЦР ограничивается анализом конкретных участков исследуемых хромосом [11].
Выбор технологии детекции и подсчета вкДНК может влиять на результат. Технология, основанная на спектрофотометрии (NanoDrop), определяет не только двуцепочечные ДНК, но и другие нуклеиновые кислоты, включая РНК, одноцепочечные ДНК и свободные нуклеотиды, что может приводить к искажению результатов (их переоценке). Методы, использующие флюоресцентные краcители (Qubit), определяют только двуцепочечные ДНК, но не дифференцируют молекулы ДНК разной длины, что может приводить к количественному определению адаптерных и праймер – димеров. Способы на основе электрофореза (Bioanalyzer) позволяют произвести визуальную оценку ампликона и исключение малых молекул праймеров и адаптеров [13].
Следует отметить, что результативность анализа значительно обусловлена также использованием и выбором конкретного метода полногеномной амплификации ДНК (ПГА). Так, по данным литературы, частота детекции вкДНК после использования методов ПГА составляет 62,5–100%, в сравнении с результатами без применения ПГА (6,7–100%). Выделяют два основных типа ПГА: основанные на ПЦР и изотермической амплификации. В литературе приводят несколько методов ПГА с различной эффективностью детекции вкДНК в отработанной культуральной среде: MALBAC (циклы амплификации, основанные на множественных отжигах и образовании петель, Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles) – 80–100%, MALBAC-like – 62,5–100%, MDA (метод изотермической амплификации, Multiple Displacement Amplification) – 96,5–100%, ПЦР – 62,9% [13].
Частота детекции вкДНК и эффективность ни-ПГТ-А вместе с тем зависит от ряда методологических и технических факторов, таких как, длительность культивирования, стадия развития эмбриона, условия забора и хранения материала, метод детекции и анализа ДНК, а также использование методов амплификации ДНК. По данным систематического обзора, частота детекции внеклеточной ядерной ДНК в отработанной культуральной среде составляет от 6,7 до 100% [13]. Увеличению частоты детекции и точности анализа способствуют сбор отработанной культуральной среды (англ. spent culture medium, SCM) на стадии бластоцисты (в сравнении с более ранними стадиями развития), продолжительность культивирования 24–48 часов (при большей длительности растет вероятность деградации ДНК), а также использование методов амплификации ДНК [13, 24, 26].
На точность диагностики также может оказывать влияние объем капли культуральной среды. В исследованиях описано использование капель объемом от 4 до 25 мкл [17]. Тем не менее, с целью концентрирования вкДНК, ученые рекомендуют использовать стандартные капли по 5–10 мкл [20]. Применение типовых инкубаторов или с технологией time lapse, а также использование одно- и двухступенчатых сред для культивирования не оказывает значительного влияния на результаты тестирования [17, 28, 29].
Оплодотворение может происходить как путем ИКСИ, так и методом ЭКО, с сопоставимой чувствительностью (87,9 и 80,9%) и специфичностью (69,9% и 78,6%). Основным условием будет являться обязательное выполнение денудации перед проведением ИКСИ или на 1-е сутки после ЭКО (контроль оплодотворения) [17, 22].
По данным исследований, более высокая концентрация эмбриональной вкДНК, а также снижение контаминации ДНК клеток кумулюса отмечается в отработанной культуральной среде бластоцист 6-х суток развития, в сравнении с 5-м днем [19]. Результаты ни-ПГТ-А для SBM, собранных на 6-е сутки, показали большую эффективность тестирования, частоту соответствия результатов с образцами биопсии ТФЭ, ВКМ и целых бластоцист [17, 22, 30]. Однако, ряд ученых ставят под сомнение вопрос безопасности культивирования эмбрионов до 6-х суток развития. Другие исследователи заявляют о возможности применения подобной технологии без влияния на клинические исходы [17, 22, 30]. Необходимы дальнейшие исследования для решения вышеописанных вопросов.
Пути повышения эффективности неинвазивного преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии
Основными факторами риска снижения эффективности ни-ПГТ-А являются контаминация внешней и материнской ДНК [13, 22, 31]. Контаминация внешней ДНК может быть связана с составом культуральной среды, лабораторными условиями культивирования и сбора образцов. Для предотвращения внешней контаминации следует культивировать эмбрионы в индивидуальных каплях, использовать защитную одежду, очки, перчатки, маски при работе с образцами среды, использовать фильтры при сборе SCM. Контаминация материнской ДНК может быть связана с клетками кумулюса или лучистого венца [13, 25, 31]. Для снижения контаминации материнской ДНК рекомендуется выполнение дополнительных «отмываний» и денудации ооцитов перед оплодотворением [13, 20].
Авторы подчеркивают, что следует с осторожностью интерпретировать беспорядочные хаотичные результаты тестирования, с большей вероятностью отражающие условиях хранения материала и процессы деградации ДНК, чем хромосомный состав бластоцист [20, 22].
Для широкого уверенного внедрения в практику ни-ПГТ-А необходимо проведение дополнительных многоцентровых рандомизированных клинических испытаний с установлением стандартизированного подхода и оценке исходов: ЧНБ, частоты прерывания беременности и родов живым плодом. Необходимо оценить, улучшает ли проведение ни-ПГТ-А исходы программ ВРТ, в сравнении с циклами ВРТ без ни-ПГТ-А у различных категорий пациенток [20].
Необходима стандартизация протокола, включая технику сбора отработанной культуральной среды, выбор суток культивирования и продолжительность культивирования, условия снижения возможной контаминации (использование персоналом защитной одежды, перчаток, масок и очков при работе с материалом, использование фильтров при сборе отработанной культуральной среды, обязательное проведение интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ), возможная замена культуральной среды на свежую, возможные серии «отмываний» эмбрионов, использование индивидуальных капель для культивирования и выбор их объема), выбор необходимости и способа амплификации ДНК, выбор метода детекции и анализа ДНК, определения порога мозаицизма. Для повышения эффективности исследования рекомендуется проводить контрольное исследование пустой (не содержащей эмбрион) среды культивирования с целью исключения дополнительного источника контаминации (в составе среды).
Дополнительные возможности неинвазивного преимплантационного тестирования на анеуплоидии
В некоторых случаях ни-ПГТ-А может использоваться в комбинации с ПГТ-А. Одним из направлений для внедрения в практику ни-ПГТ-А может стать дополнительная диагностика эмбрионов, мозаичных по результатам биопсии ТФЭ. Авторы утверждают, что ни-ПГТ-А может быть более информативной, учитывая, что внеклеточная ДНК отработанной культуральной среды включает материал клеток не только ТФЭ, но и ВКМ [21, 22].
Вопрос потенциала к развитию мозаичных эмбрионов на сегодняшний день остается открытым. Ряд авторов утверждают о снижении частоты имплантации и повышении частоты выкидышей при переносе мозаичных эмбрионов [32, 33]. В литературе описан случай рождения больного ребенка после переноса мозаичного эмбриона [34]. Однако, имеются также данные, подтверждающие эквивалентный потенциал к имплантации и рождению здорового ребенка для эуплоидных эмбрионов и эмбрионов, с уровнем мозаицизма менее 50% по данным биопсии ТФЭ (оценивались репродуктивные, акушерские и неонатальные исходы для 484 эуплоидных бластоцист и 413 мозаичных эмбрионов) [29].
Согласно позиции Международного общества преимплантационной генетической диагностики (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society, PGDIS) относительно переноса мозаичных эмбрионов от 2021 г., такие эмбрионы могут использоваться для переноса без дополнительного риска аномальных исходов родов, но могут быть связаны с повышением частоты неудач имплантации и частоты прерываний беременности. При этом, более высокие показатели уровня мозаицизма эмбриона (в %) ассоциированы с повышением риска неудачи имплантации и выкидыша, что следует учитывать при принятии решения о переносе мозаичного эмбриона [33].
В 2021 г. Li X. et al. провели пилотное исследование, в котором оценивали эффективность ни-ПГТ-А для оценки хромосомных аномалий у мозаичных эмбрионов по результатам исследования ТФЭ. Ученые разморозили и рекультивировали в течение 14–18 часов 41 мозаичный эмбрион с дальнейшей генетической диагностикой отработанной культуральной среды, клеток ТФЭ и всего эмбриона. При последующем исследования клеток всего эмбриона 35 (85,4%) бластоцист были эуплоидными, а бластоцисты с уровнем мозаицизма менее 50% были эуплоидными в 100%. Показатели результатов ни-ПГТ-А и биопсии ТФЭ соответствовали биопсии всего эмбриона в 74,4 и 82% случаев соответственно. При установлении порога мозаицизма в 50%, уровень соответствия результатов повысился до 87,2 и 85%, соответственно. Кроме того, по данным ретроспективного анализа данных, авторы доложили о переносе мозаичных эмбрионов для 60 пар, не имевших эуплоидные эмбрионы после ПГТ-А. У 30 из них (50%) наступила клиническая беременность [35]. Таким образом, исследователи подчеркнули высокий потенциал к применению ни-ПГТ-А в качестве дополнительного неинвазивного тестирования мозаичных бластоцист с целью выбора эмбриона для возможного переноса.
Заключение
Успех программ ВРТ зависит во многом от качества полученных эмбрионов. Однако морфологические критерии оценки качества эмбрионов являются недостаточными для прогнозирования наступления клинической беременности. А применяемые в клинической практике методы ПГТ-А являются инвазивными, дорогостоящими, занимают большое время, требуют отмены переноса в нативном цикле и не гарантируют успешного наступления беременности.
Новый неинвазивный подход к оценке качества эмбрионов позволит с большей эффективностью производить выбор эмбрионов с высоким потенциалом к дальнейшему развитию, продолжающейся беременности и рождению здорового ребенка. Указанная методика позволит большему числу пациентов получить необходимую медицинскую помощь, сократит время до наступления беременности, а также сделает диагностический процесс более экономически эффективным.
