Необходимость осуществления эффективной криоконсервации возникла вскоре после первого успешного применения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) при лечении бесплодия в 1978 г. В свою очередь, криоконсервация эмбрионов стала возможной в результате быстрого развития и совершенствования программ вспомогательных репродуктивных технологии (ВРТ). Первоначально все полученные эмбрионы переносились в полость матки пациентки при проведении программы ЭКО, при этом эффективность лечения бесплодия была относительно низкой. Однако совершенствование программ ВРТ способствовало как повышению частоты беременности на один цикл переноса эмбрионов в полость матки, так и увеличению риска многоплодной беременности [1, 2].
Для предотвращения риска развития многоплодной беременности количество переносимых эмбрионов сводили к минимуму, остальные эмбрионы криоконсервировали с возможностью их последующих переносов [2, 3]. С этого момента криоконсервация эмбрионов стала неотъемлемой частью лечения бесплодия с помощью программ ВРТ. Этот метод с успехом применяется у женщин с риском развития синдрома гиперстимуляции яичников, в программе донорства эмбрионов, а также с целью сохранения фертильности у женщин, которым планируется проведение гонадотоксичной терапии. При этом эффективность программ ВРТ определяет ряд факторов: критерии отбора подлежащих криоконсервации эмбрионов, способы замораживания и разморозки эмбрионов, синхронизация развития эмбриона и эндометрия, гормональная подготовка эндометрия и индивидуальные характеристики пациентки [4–8].
Следует отметить, что в настоящее время отсутствуют единые протоколы подготовки эндометрия к переносу криоконсервированных эмбрионов, не определена целесообразность использования циклической гормональной терапии для тех или иных категорий пациенток. Не выработана единая эмбриологическая тактика при осуществлении процедуры оттаивания эмбрионов. Четко не определены показания для использования вспомогательного хетчинга и других эмбриологических методик, используемых в ходе выполнения программ криопереноса эмбрионов. Также не определены показатели качества эндометрия, необходимые для имплантации эмбриона.
Цель работы – анализ данных литературы о возможностях криоконсервации эмбрионов при лечении бесплодия.
Общие сведения о механизмах криоконсервации клеток
Принцип криоконсервации основан на сохранении жизнеспособности клеток за счет повышения внутри- и внеклеточной вязкости жидкости до уровня, при котором диффузия молекул и обменные процессы в клетке останавливаются. Замораживание приводит к образованию и последующему росту кристаллов льда, при этом все соли остаются в виде незамерзшей фракции [1, 3]. Эти два явления, а именно образование кристаллов льда и повышение концентрации солей, являются основными причинами повреждения клеток и возможной их гибели, связанной с криоконсервацией [9, 10]. Для предотвращения повреждений клеток используемые протоколы криоконсервации должны обеспечивать обезвоживание внутриклеточного пространства, что приводит к минимизации образования внутриклеточного льда при сохранении низких концентраций внутриклеточной соли [2, 11].
Вспомогательный хетчинг
В настоящее время в качестве причин отсутствия имплантации криоконсервированных эмбрионов рассматривается невозможность выхода бластоцисты из блестящей оболочки (англ. ZP – zona pellucida). Вероятной причиной отсутствия самостоятельного хетчинга криоконсервированных эмбрионов являются отличные от физиологических условия культивирования или криоконсервации, приводящие к уплотнению ZP, что затрудняет выход бластоцисты [12].
В проведенных ранее исследованиях было показано, что основными клиническими предикторами самостоятельного хетчинга являются качество бластоцисты, исходная морфология ооцита, базальный уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) пациентки, а также использование различных препаратов в качестве триггера овуляции [13]. При этом показано, что при вспомогательном хетчинге в виде полного удаления ZP частота наступления беременности увеличивается в 1,9 раза по сравнению с частичным удалением ZP или отсутствием вспомогательного хетчинга. По данным автора, отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии к нему показаний снижает частоту живорождения в 1,9 раза; в то же время вспомогательный хетчинг при отсутствии к нему показаний увеличивает риск монозиготной многоплодной беременности в 6 раз [4]. Однако в вышеприведенном исследовании авторы изучали эффективность переноса «свежих» эмбрионов в полость матки.
В другом исследовании оценивали вероятность самостоятельного хетчинга бластоцист, донированных для проведения научных исследований. Основными предикторами самостоятельного хетчинга являются высокое качество эмбриона, а также экспрессия генов катепсина. При этом в группе эмбрионов после криоконсервации эффективность хетчинга также была выше [14]. По мнению авторов, полученные различия могут быть обусловлены тем фактом, что в группе эмбрионов после криоконсервации эмбрионы были более высокого качества. Следует отметить, что влияние непосредственно криоконсервации/оттаивания на вероятность самостоятельного хетчинга бластоцисты остается предметом дискуссии.
Одной из наиболее популярных технологий является хетчинг с помощью лазера, однако эффективность его применения в ходе осуществления переноса криоконсервированных эмбрионов после оттаивания до настоящего времени дискутируется. Целью метаанализа, проведенного Zeng M. et al. (2018), была оценка влияния лазерного хетчинга на исходы ВРТ после оттаивания криоконсервированных эмбрионов. Было показано, что применение хетчинга связано с более высокой частотой имплантации эмбрионов и клинической беременности у пациенток при переносе криоконсервированных эмбрионов [12].
Оценка качества эндометрия в программах криопереноса эмбрионов
Эндометрий человека претерпевает циклические изменения во время менструального цикла, при этом изменяются его рецептивность и готовность к имплантации эмбриона. Подобное ремоделирование эндометрия обусловлено воздействием прогестерона [15]. Эндометрий восприимчив к имплантации эмбриона только в течение 6–10 дней после достижения пикового уровня в крови лютеинизирующего гормона (ЛГ). Однако низкое качество эмбрионов, а также сниженная рецептивность эндометрия приводят к нарушениям процессов имплантации, поэтому необходима синхронизация развития эмбриона и эндометрия [16].
Адекватное развитие эндометрия в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла, а также правильная синхронизация между рецепторами эндометрия, бластоцистой и гормонами желтого тела являются условиями наступления беременности. Успех этого взаимодействия зависит от морфофункционального состояния эндометрия в период «окна имплантации». Процесс трансформации эндометрия протекает на фоне изменений как морфологической структуры эндометрия, так и уровней секреции различных регуляторных факторов – биологически активных веществ (гормонов, цитокинов, молекул адгезии, факторов роста и др.) [16].
Результаты изучения процессов имплантации эмбриона послужили основой для разработки различных методов оценки рецептивности эндометрия. Наиболее распространенным методом оценки его качества является ультразвуковое исследование с оценкой толщины и структуры эндометрия. Считается, что оптимальная толщина эндометрия на момент переноса эмбриона в полость матки должна составлять 8–12 мм. В ряде работ было продемонстрировано, что толщина эндометрия менее 8 мм является прогностически неблагоприятным фактором в отношении наступления и исхода беременности в циклах ВРТ, в частности, ранней потери беременности и высокой частоты внематочной беременности [15, 17].
Систематический обзор и метаанализ, посвященные влиянию толщины эндометрия на частоту наступления беременности в программе ЭКО, были опубликованы Kasius et al. в 2014 г. В анализ вошли 22 исследования, в которых были оценены исходы 10 724 циклов ЭКО, из них только в 260 (2,4%) циклах толщина эндометрия составила 7 мм и ниже. Выявлена тенденция к снижению частоты родов живым плодом, а также значительное снижение частоты клинической беременности у женщин с толщиной эндометрия 7 мм и ниже. Тем не менее, в связи с невысокой прогностической значимостью данного критерия (положительная прогностическая значимость 77%, отрицательная — 48%), авторы не советуют руководствоваться толщиной эндометрия для принятия решения о замораживании всех эмбрионов, отмене переноса и отказе от лечения методом ЭКО [18].
При неэффективности ультразвуковой оценки качества эндометрия используют инвазивные методы диагностики (например, биопсию эндометрия) с определением различных маркеров – гистологических (пиноподии, стадии развития эндометрия), биохимических (интегрины, лейкемия-ингибирующий фактор, кальцитонин и т.д.) и молекулярных (так называемые «омиксные» технологии – протеомика, транскриптомика и т.д.) [19]. Транскриптомные технологии, т.е. изучение экспрессии панели генов на различных стадиях развития эндометрия, являются наиболее перспективным методом оценки его качества [20]. Тем не менее проблема оценки качества эндометрия остается нерешенной на сегодняшний день. Основными сложностями являются:
- недостаточная информативность различных маркеров рецептивности эндометрия;
- рецептивность эндометрия может различаться не только у разных женщин, но и у одной и той же пациентки в различных менструальных циклах;
- для максимальной точности измерения требуется изучение непосредственно эндометрия, что делает диагностику инвазивной и не позволяет выполнить ее непосредственно в день переноса эмбрионов. Неинвазивные методы оценки рецептивности обладают меньшей точностью;
- рецептивность эндометрия может изменяться в зависимости от схемы подготовки эндометрия.
Схемы подготовки эндометрия в программе криопереноса эмбрионов
Для имплантации эмбриона необходимо сочетанное воздействие на эндометрий двух основных стероидных гормонов – эстрогена и прогестерона. В связи с этим применяются различные препараты, обеспечивающие поступление в организм стероидных гормонов. При наличии овуляторного цикла возможным является перенос размороженного эмбриона в так называемом «естественном» цикле. Все вышеперечисленное обуславливает наличие различных схем подготовки эндометрия в программе криопереноса эмбрионов. При этом не существует алгоритмов для использования определенных схем подготовки эндометрия у различных категорий пациенток (например, в зависимости от возраста, индекса массы тела, наличия гинекологических заболеваний или гормональных особенностей).
К основным методам подготовки эндометрия в криоциклах относятся:
- «естественный» цикл: по результатам ультразвукового и гормонального мониторинга определяется день самостоятельной овуляции, после которого планируется день переноса размороженного эмбриона. В ряде случаев для инициации разрыва фолликула назначают инъекцию триггера овуляции (так называемый «модифицированный» естественный цикл). Большинство исследований демонстрирует отсутствие различий в эффективности вышеуказанных протоколов [5];
- «циклическая гормональная терапия (ЦГТ)»: после проведения ультразвукового контроля (при отсутствии патологии) со 2–4-го дня менструального цикла начинается введение эстрогенов, а при достижении нормальной толщины и структуры эндометрия на 14–15-й день цикла осуществляется введение гестагенов. В ряде случаев введение экзогенных гормонов не подавляет рост собственного фолликула, что приводит к отмене цикла переноса или к необходимости введения триггера овуляции для синхронизации между желтым телом, эндометрием и эмбрионом. С целью профилактики преждевременной овуляции и улучшения контроля над состоянием эндометрия также используют депо-формы агониста гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ) в лютеиновую фазу менструального цикла [21];
- контролируемая индукция овуляции низкими дозами гонадотропинов на сегодняшний день используется крайне редко, что объясняется относительно высокой стоимостью препаратов гонадотропина, низкой эффективностью и дискомфортом для пациентки.
Наиболее широко используемой схемой подготовки эндометрия является ЦГТ. Показано, что прием от 2 до 6 мг эстрадиола ежедневно, начиная с 1–3-го дня менструального цикла, в 90–96% случаев приводит к подавлению роста доминантного фолликула, блокирует выброс ЛГ и позволяет выбирать произвольно дату переноса размороженных эмбрионов [22]. При этом доза эстрогенов, необходимая для подавления роста доминантного фолликула, не определена. Также не определено влияние наличия/отсутствия доминантного фолликула и необходимость введения экзогенных препаратов на частоту наступления клинической беременности. Одним из недостатков такого подхода является необходимость постоянного приема высоких доз препаратов эстрадиола и прогестерона во время беременности, как минимум до 8–10 недель. Тем не менее такой вариант подготовки к переносу является единственно возможным у пациенток со стойкой или спорадической ановуляцией. В качестве эстрогенов наиболее часто используются пероральные или трансдермальные формы, в качестве гестагенов – пероральные, вагинальные и инъекционные формы.
Несмотря на многолетние исследования в данной области, единого протокола назначения ЦГТ не существует. Определено, что назначение ЦГТ необходимо при ановуляторном бесплодии, а также у женщин после овариэктомии. Дискуссионными считаются в настоящее время такие вопросы, как срок начала гормональной терапии, необходимая доза эстрогенов, срок введения гестагенов и необходимость динамического повышения дозы гестагенов. Преимуществами использования ЦГТ являются небольшое число требуемых ультразвуковых мониторингов (обычно 3–4 за цикл подготовки), а также эффективный контроль над состоянием эндометрия и низкая частота отмены переноса эмбрионов.
Отсутствует единое мнение о целесообразности назначения высоких доз экзогенных стероидных гормонов женщинам с сохраненным овуляторным циклом (особенно на ранних сроках беременности). Также следует учитывать, что при назначении ЦГТ неэффективен мониторинг уровня стероидных гормонов, так как метаболиты синтетических препаратов не определяются в крови пациенток.
Результаты большинства исследований демонстрируют отсутствие различий в эффективности протоколов подготовки эндометрия к переносу криоконсервированных эмбрионов [23, 24] или более высокую эффективность использования ЦГТ [25]. В ряде сообщений было показано повышение частоты наступления беременности у женщин с эндометриозом/аденомиозом при использовании ЦГТ на фоне применения препаратов аГнРГ [23]. Высокая эффективность ЦГТ, вероятнее всего, связана с более точным определением окна имплантации.
Следует отметить, что не все авторы отличают естественные циклы с использованием триггера овуляции от полностью естественных циклов, а при назначении ЦГТ используют различные схемы препаратов, что, вероятно, влияет на получаемые результаты.
В последние несколько лет общие показатели успешности переноса криоконсервированных эмбрионов возросли. Приводятся данные о более высокой эффективности криопротоколов по сравнению с использованием «свежих» протоколов ЭКО. По данным Европейской Ассоциации Репродукции Человека и Эмбриологии (англ. ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology), около 25% всех циклов ВРТ в США сопровождаются плановой криоконсервацией эмбрионов, поскольку частота наступления при проведении криопереноса выше (56,5% и 44,7% соответственно) [26].
Заключение
Таким образом клиническая и эмбриологическая тактика при проведении программы ЭКО с криоконсервированными эмбрионами четко не определена. Не изучена эффективность вспомогательных эмбриологических методик при переносе криоконсервированных эмбрионов. Наблюдается высокая вариабельность протоколов подготовки эндометрия к криопереносу. Результаты проведенных к настоящему времени исследований в большинстве своем являются ретроспективными. Не изучена экономическая эффективность широкого использования ЦГТ. Все вышеперечисленное диктует необходимость дальнейшего изучения данной проблемы.
