Введение
За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Интенсивно изучаются механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигнала от рецепторов в ядро и т.д. [1]. Оказалось, что структурные и функциональные изменения некоторых белков, участвующих в этих процессах, могут приводить к трансформации клеток. Стало известно, что злокачественный фенотип опухоли определяется сочетанием множества молекулярных изменений, накопление которых в процессе развития и прогрессирования опухоли обусловлено нарушением активности и функционирования ряда генов, в частности протоонкогенов, генов-супрессоров опухолевого роста (антионкогенов) и продуктов их экспрессии [2–5]. Обнаружено, что существует большая группа генов-модуляторов, не отвечающих за злокачественную трансформацию клеток, но способствующих распространению опухоли. Сведения о структурных и функциональных изменениях в генах послужили основой для выделения клинически значимых молекулярных факторов. Особенности экспрессии кодируемых этими генами белков могут выявляться иммуногистохимическими (ИГХ) методами в клетках колоректального рака (КРР) и служить специфическими показателями биологической активности раковых клеток.
Межклеточные взаимодействия, регулирующие статус и поведение нормальных клеток, определяют также и способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию – одному из важнейших механизмов развития и прогрессирования злокачественных новообразований человека, в т.ч. КРР. Понимание всех этих процессов невозможно без выявления взаимосвязи клинических проявлений заболевания с активностью целого ряда молекул, влияющих на биологическое поведение опухоли [6–10]. Исследование особенностей биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем онкологии.
Общие представления о молекулярно-биологических маркерах
На сегодняшний день известно более 100 белков и/или генов, изменения которых ассоциированы с ростом злокачественных клеток. Каждая опухоль уникальна по набору нарушений, вовлеченных в процессы канцерогенеза. Такие нарушения, определяемые в опухолевой ткани, и получили название молекулярно-биологических маркеров (МБМ) [11]. Другими словами, МБМ опухолей – это определенные хромосомные и генные мутации, а также экспрессия различных молекул клеточного и иного происхождения, подвергающихся качественным или количественным специфическим изменениям и участвующих в развитии и прогрессировании злокачественных заболеваний [1].
Основная цель исследования МБМ, наряду с улучшением понимания механизмов патогенеза болезни, – это анализ возможности их использования для определения индивидуального риска развития злокачественных новообразований, диагностики болезни в ранние сроки развития, оценки прогноза заболевания, выявления больных с достаточно высоким риском рецидива болезни и/или метастазирования, обоснования выбора индивидуальной тактики лечения, а также для предсказания эффективности проводимого лечения.
Большинство изучаемых на сегодняшний день МБМ контролируют 6 основных патологических клеточных процессов, которые совместно определяют способность клетки к злокачественному росту: независимость от ростовых сигналов; нечувствительность к сигналам, блокирующим деление; уклонение от программированной клеточной гибели (апоптоза); возможность неограниченного деления; адекватный ангиогенез; способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию [12].
Основные методы определения статуса белков в ткани основаны на 2 подходах: определение изменений на геномном (по амплификации гена, увеличению числа копий мРНК, наличию мутантного гена) или белковом уровне (по гиперэкспрессии белка, экспрессии мутантного белка) [13].
Большое внимание онкологов привлекают сегодня новые терапевтические подходы, базирующиеся на достижениях молекулярной биологии. Появилось множество сообщений, согласно которым определение экспрессии МБМ в опухоли может не только давать дополнительную информацию о клиническом течении злокачественного процесса независимо от лечебного воздействия, о биологическом поведении опухоли: быстроте роста, способности к инвазии и метастазированию (прогностическая роль МБМ); но и позволяет предсказывать чувствительность/резистентность конкретного новообразования к специфической противоопухолевой терапии (предиктивная роль) [1].
МБМ, которые могли бы использоваться для прогнозирования течения опухолевого процесса, должны соответствовать определенным критериям [14]. Маркер должен иметь ясную биологическую значимость (прогностическое значение маркера может быть объяснено его механизмом действия в клетке), тестироваться стандартизованными методами (в т.ч. ИГХ), иметь оптимальную точку разделения опухолей на (+) и (-) – т.н. разграничительную («cut-off») точку. Результаты тестирования маркера должны воспроизводиться в различных лабораториях. Должна быть определена группа больных, для которых маркер имеет прогностическое значение, а прогностическая значимость – подтверждена в достаточном количестве ретро- и проспективных исследований.
Правильная оценка биологических факторов, коррелирующих с прогнозом заболевания и продолжительностью жизни пациентов, важна как при локализованных формах КРР, так и при наличии отдаленных метастазов [15, 16]. Некоторые молекулярные факторы коррелируют с прогнозом заболевания не только после удаления первичной опухоли, но и после резекции печени по поводу метастазов [15–18], а также необходимы для планирования лекарственной терапии и эффекта от ее проведения [7, 11, 19–21].
За последнее десятилетие проведена масса исследований, посвященных изучению МБМ при КРР [1, 22, 23]. Появились новые возможности прогнозирования течения болезни и выбора обоснованной терапии [1]. Большинство работ, посвященных оценке клинической значимости МБМ при КРР, сосредоточено на факторах, ответственных за пролиферацию и апоптоз (Ki-67, p53, Bcl-2, Bax и др.). Соотношение скорости клеточной пролиферации и активности индукторов и ингибиторов апоптоза обусловливает опухолевое прогрессирование и влияет на развитие дополнительных компонентов злокачественного фенотипа клеток КРР [8, 10, 11].
Очевидно, что несостоятельность сложившихся систем выявления прогностически неблагоприятных групп больных КРР обусловлена биологической гетерогенностью опухолей [24]. Именно данная разнородность обусловливает возможные неблагоприятные исходы лечения КРР, стандартизованного по системе TNM, что может выражаться в «перелечивании» (проведение адъювантной терапии при заведомо благоприятном прогнозе) или «недолечивании» пациентов (отсутствие адъювантного лечения при ожидаемом плохом исходе) [25]. В мире предпринимаются попытки изменения сложившейся ситуации и разработки линеек МБМ, которые могут использоваться для более точного определения прогноза заболевания и выработки показаний для проведения дополнительных методов лечения у больных КРР.
Молекулы межклеточной адгезии при колоректальном раке
Среди множества МБМ, которые могут влиять на клиническое течение КРР, особое место отводится поиску маркеров, прогнозирующих метастазирование [18, 26]. Молекулярно-биологические факторы, влияющие на метастатический потенциал злокачественных новообразований, в т.ч. КРР, составляют особую группу и связаны как с нарушениями в самих опухолевых клетках, так и с состоянием внеклеточного матрикса (ВКМ) [27–29]. Клиническую значимость в процессе прогрессирования и метастазирования КРР имеют изменения активности и взаимодействия таких факторов эпителиального и стромального происхождения, как адгезивные белки и молекулы межклеточных контактов; белки и гликопротеиды ВКМ; протеолитические ферменты, секретируемые клетками опухоли и ВКМ; факторы роста и их рецепторы; опухолевые супрессоры. Кроме того, нельзя не учитывать некоторые аспекты взаимодействия этих факторов с основными показателями пролиферативной активности опухолевых клеток и апоптоза.
К наиболее интересным и активно изучаемым в настоящее время молекулярным факторам относятся молекулы, непосредственно влияющие на приобретение опухолевыми клетками высокой инвазивной способности. К ним относятся белки межклеточной адгезии и адгезивные рецепторы, нарушения нормальной экспрессии и функционирования которых способствуют формированию метастатического фенотипа клеток КРР (т.е. приобретению опухолевыми клетками свойства отделяться от первичного очага), что имеет большую клиническую значимость в процессе прогрессирования КРР [6, 30–33]. Наиболее важные факторы межклеточной адгезии – это молекулы семейства кадхеринов.
Кадхерины – семейство Ca2+-зависимых молекул межклеточной адгезии, которые осуществляют гомофильные межклеточные взаимодействия и являются важной составной частью адгезивных контактов, ответственных за организацию цитоскелета клетки и обеспечение структурной целостности тканей [23, 34]. Наиболее клинически значимым членом семейства кадхеринов, нарушения экспрессии которого часто наблюдаются при КРР, и роль которого в развитии метастазов КРР изучена недостаточно, является е-кадхерин.
Е-кадхерин (ген локализован в хромосоме 16q22.1) – трансмембранный гликопротеин, обеспечивающий Са2+-зависимое образование адгезивных межклеточных контактов между эпителиальными клетками.
На ультраструктурном уровне межклеточные взаимодействия выражаются в формировании плотных контактов типа «zona occludens», расположенных в апикальных участках плазматических мембран, и расположенных сразу под плотными контактами адгезивных контактов типа «zona adhaerence», в которых через внутриклеточные прикрепляющие белки (катенины) происходит взаимодействие е-кадхерина с актиновыми молекулами цитоскелета клетки, расположенными на цитоплазматических мембранах в местах контакта (зоны адгезии) между опухолевыми клетками [35, 36].
Морфологические нарушения адгезивных взаимодействий клеток друг с другом и с ВКМ выражаются в нарушении формирования фокальных контактов, ухудшении прикрепления клеток друг к другу и к матриксу, дезорганизации системы актиновых микрофиламентов. Подобные нарушения в системе межклеточной адгезии – один из начальных этапов опухолевой прогрессии [23, 37].
Клиническая значимость е-кадхерина связана с его свойствами супрессора опухолевого роста и инвазивности и подтверждена при изучении злокачественных опухолей человека различных локализаций, в т.ч. при КРР [23, 37–42].
Большинство работ сосредоточено на изучении влияния экспрессии е-кадхерина на метастатический потенциал КРР [6, 30–32]. Результаты исследований свидетельствуют, что существует тесная взаимосвязь между уровнем экспрессии маркера в первичной опухоли и развитием регионарных и отдаленных метастазов КРР. Снижение экспрессии е-кадхерина в опухолевых клетках и уменьшение в связи с этим межклеточной адгезии увеличивают вероятность лимфогенного [43–46] и гематогенного распространения опухоли [41].
В ряде работ показана достоверная взаимосвязь утраты е-кадхерина в первичной опухоли с такими неблагоприятными морфологическими параметрами КРР, как инвазия кровеносных и лимфатических сосудов, низкая степень дифференцировки опухоли, большая глубина инвазии и поздняя стадия заболевания [47]. Т. Matsuoka et al. отметили снижение степени дифференцировки, увеличение стадии заболевания, сокращение общей выживаемости (ОВ) на фоне уменьшения мембранной экспрессии е-кадхерина и β-катенина в первичной опухоли [48].
Клинические исследования экспрессии белка при КРР свидетельствуют, что е-кадхерин является ключевым фактором метастазирования и важным прогностическим маркером для опухолей данной локализации [6, 30, 32, 49–53]. Экспрессия е-кадхерина в первичных опухолях значительно ниже на поздних стадиях заболевания, т.е. у больных метастатическим КРР (мКРР), чем у пациентов без метастазов [6, 30–32, 51–55]. Низкий уровень экспрессии е-кадхерина при этом отмечается не только в первичных метастазирующих аденокарциномах толстой кишки (АТК), но и в оперативно удаленных метастазах в печени и коррелирует с плохой ОВ больных КРР после удаления метастазов в печени [56]. При многофакторном статистическом анализе показано значение е-кадхерина как независимого фактора прогноза ОВ для больных КРР.
Наиболее значительные изменения экспрессии молекул адгезии наблюдаются в клетках, отпочковавшихся от основных раковых комплексов в зонах роста опухоли, и характерны для новообразований с высоким инвазивным потенциалом [57, 58].
Отмечают, что на инвазивный потенциал опухолевых клеток при КРР влияет изменение локализации е-кадхерина: исчезновение мембранного окрашивания и аномальное накопление в цитоплазме опухолевых клеток [59]. Показано, что полная потеря мембранной экспрессии белка и появление цитоплазматической реакции связаны с возрастанием агрессивности опухоли, появлением регионарных и отдаленных метастазов, местных рецидивов [47]. Причем, исчезновение мембранного е-кадхерина ассоциировано с увеличением инвазивности как в случаях местнораспространенного, так и мКРР [60, 61].
Существует мнение, что потеря молекул адгезии и адгезивных структур сопровождает развитие инвазивного фенотипа раковых клеток. Однако эти данные подтверждаются не во всех исследованиях. Ряд авторов демонстрируют, что при КРР, несмотря на развитие инвазивного фенотипа, сохраняется синтез основных белков адгезии. Так, J. Kartenbeck et al. [62], исследуя экспрессию белков и структуру межклеточных контактов с помощью световой и электронной ИГХ, показали сохранение в процессе опухолевой инвазии синтеза десмосомальных белков и белков зон адгезии. При этом отмечалось формирование только десмосомальных структур и отсутствие контактов типа «zona adhaerens», а е-кадхерин в связанном с α- и β-катенинами состоянии был распределен по плазматической мембране опухолевых клеток.
Имеются сообщения, согласно которым растворимый е-кадхерин, обнаруженный в сыворотке крови больных КРР, может рассматриваться в качестве потенциального маркера опухолевого прогрессирования [63].
Таким образом, подводя итоги, нужно сказать, что изменения в гене е-кадхерина (мутации, делеции, метилирование) вызывают потерю экспрессии белка и нарушение межклеточных контактов, а также инициируют передачу сигналов, активирующих супрессорные белки (р53) и последующее развитие изменений в регуляции клеточного цикла и апоптоза [2, 35]. Следовательно, е-кадхерин имеет двойную функцию в клетках эпителиальных новообразований. Во-первых, участвует в межклеточной адгезии. Адгезивная функция молекулы е-кадхерина осуществляется путем взаимодействия с актином цитоскелета через внутриклеточные прикрепляющие белки, представленные α-, β- и γ-катенинами. Бета- и γ-катенины взаимодействуют непосредственно с цитоплазматической областью е-кадхерина, тогда как α-катенин соединяется с β-катенином и связывает комплекс с сетью микронитей актина. Во-вторых, е-кадхерин является частью комплекса сигнального пути. Причем, существует предположение, что действие е-кадхерина как супрессора опухолевого роста обусловливается, в первую очередь, его способностью связывать β-катенин и не зависит от того, происходит ли при этом восстановление межклеточных контактов [35].
Приводятся результаты исследований, свидетельствующие, что восстановление экспрессии е-кадхерина в раковых клетках вызывает замедление пролиферации и переход от инвазивного к неинвазивному фенотипу, и маркер может использоваться в качестве мишени при терапии злокачественных опухолей человека [35]. Исходя из сказанного, восстановление экспрессии е-кадхерина может стать одним из подходов к разработке новых схем противоопухолевой терапии.
Заключение
Идентификация механизма функционирования кадхерин-катениновой системы межклеточных адгезивных взаимодействий, нарушение которого в опухолях человека лежит в основе формирования инвазивного фенотипа, является одним из важнейших научных достижений последних лет. Утрата функции и/или экспрессии любого из элементов комплекса е-кадхерин/β-катенин (например, вследствие мутации в гене е-кадхерина и/или β-катенина) приводит к нарушению межклеточных контактов, увеличению стабильности β-катенина в цитоплазме, накоплению β-катенина в ядре и повышению его транскрипционной активности. В результате стимулируется деление клеток, и увеличивается их способность к инвазии. При восстановлении е-кадхерина в клетке его внутриклеточный домен связывается с β-катенином, и последний перестает функционировать в качестве транскрипционного фактора (β-катенин может функционировать как фактор транскрипции только в не связанном с е-кадхерином состоянии), а взаимодействует с актиновыми микрофиламентами и участвует в организации клеточных контактов по типу «zona adhaerens». Этим обусловлена прогностическая значимость различных моделей экспрессии рассматриваемых маркеров в АТК и их метастазах.
