Актуальность
Злокачественные опухоли слюнных желез составляют 0,3% от всех опухолей и до 4% от злокачественных новообразований челюстно-лицевой области и шеи [1].
Основным методом радикального лечения данной патологии, особенно на ранних стадиях развития заболевания, считается хирургическое лечение [2, 3].
Лечение местнораспространенных рецидивирующих или метастатических форм – трудная задача для клинических онкологов. К сожалению, по данным многих авторов, злокачественные опухоли слюнных желез малочувствительны к лучевой терапии или вовсе радиорезистентны [4–7], а использование системной лекарственной терапии зачастую является малоэффективным методом, ограниченным выраженными токсическими осложнениями [8].
Наличие в опухоли хотя бы одного неблагоприятного морфологичекого фактора снижает 5-летнюю общую выживаемость с 95 до 35%, а также повышает риск регионарного и отдаленного метастазирования [6, 7, 9, 10].
Целью исследования стало изучение частоты экспрессии мРНК гена RET в злокачественных опухолях слюнных желез как возможного прогностического фактора течения заболевания. Как известно, протоонкоген RET (REarranged during Transfection) кодирует тирозинкиназу рецепторного типа. Он локализован на длинном плече хромосомы 10 (10q11.2) и охватывает около 60 kb геномной ДНК, включает 21 экзон [11].
Методы
Для изучения экспрессии мРНК гена RET отобрана группа пациентов, общее число опухолей слюнных желез у которых составило 52.
Все пациенты были госпитализированы в СПбГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» с диагнозом злокачественного новообразования слюнной железы в период с 2012 по 2014 г. Среди пациентов были 27 (56,25%) мужчин и 21 (43,75%) женщина в возрасте от 42 до 69 лет, медиана возраста составила 48 лет (95% доверительный интервал [ДИ] – 45– 63).
У большинства (32; 86,66%) пациентов первичная опухоль локализовалась в околоушной слюнной железе, у 5 (10,42%) – в подчелюстной слюнной железе, у 11 (2,92%) пациентов были поражены малые слюнные железы слизистой оболочки полости рта.
У 5 (10,42%) пациентов была зарегистрирована I, у 18 (37,5%) – II, у 23 (47,92%) – III и у 2 (4,16%) – IVA-стадии заболевания.
Источником мРНК служили архивные патоморфологические образцы опухолевой ткани. Архивные срезы депарафинизировали с помощью ксилола, регидратировали путем инкубации в 96%-, 80- и 70%-ном этаноле и лизировали на протяжении 16 часов при 60°C. Состав лизирующего буфера включил 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 мM EDTA, 2% SDS, и 500 мкг/мл протеиназы К. Экстракция производилась реагентом TriZol и хлороформом. Затем мРНК осаждали изопропанолом в присутствии гликогена, промывали 70%-ным этанолом и растворяли в воде. Полученный раствор РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реакции обратной транскрипции. В состав реакционной смеси входили 10 мкл раствора РНК, 10хбуфер для обратной транскриптазы (2,0 мкл), обратная транскриптаза M-MulV (Sibenzyme) (150,000 U/ml) (1,0 мкл), смесь dNTP (10 мМ каждого) (1,0 мкл), случайные гексапраймеры (конц. 10 ое/мл) (1,0 мкл), ингибитор РНКаз (5 U/мкл) (1,0 мкл). Температурный режим обратной транскрипции: 20°С – 5 минут, 38°С – 30, 95°С – 5 минут.
Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) для оценки экспрессии проводилась в объеме 20 мкл и включила 1 мкл раствора кДНК, 1 ЕД ДНК-полимеразы, 1-кратный ПЦР-буфер (pH – 8,3), 2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0,3 мкМ прямого и обратного праймеров SDHA (ген-рефери) и RET ex12–14 (киназный домен), 0,3 мкМ соответствующих TaqMan-зондов (SDHA-P, RETex13-P). Реакция состояла из 45 циклов (денатурация: 15 секунд при 95°C; синтез: 55 при 60°C).
Последовательность праймеров и TaqMan-зондов представлена в таблице.
Относительная экспрессия рассчитывалась по формуле 2-∆Ct, где Ct – Cycle threshold (пороговый цикл), ∆Ct=Ct (RET – ген-мишень) – Ct (SDHA – ген-рефери).
Выделение мРНК было успешным в 48 случаях.
Результаты исследования
Всем пациентам в рамках радикального лечения проведено хирургическое лечение в установленном существующими стандартами объеме (с учетом локализации, клинической стадии процесса, результатов дооперационного цитологического исследования).
Послеоперационное морфологическое исследование выявило следующие гистологические формы поражения слюнных желез: у 12 (25,00%) пациентов верифицирована аденокарцинома, у 17 (35,42%) – аденокистозный рак, по 3 (6,25%) случая – ацинозноклеточный, солидный и мукоэпидермоидный рак (соответственно), по 2 (по 4,17%) – базальноклеточная карцинома, цистаденокарцинома, миоэпителиальная карцинома, и по 1 (2,08%) случаю – камедокарцинома, анапластическая полиморфноклеточная карцинома, крибриформная и лимфэпителиальная карцинома.
Экспрессия RET выявлена в 13 из 48 случаев, что составило 27,08% обследованных опухолей (иными словами, практически у трети обследованных). Уровень экспрессии варьировался от 0 до 0,205.
Обсуждение
На сегодняшний момент имеются единичные данные о частоте встречаемости экспрессии RET в опухолях слюнных желез. Анализ базы данных PubMed позволил выявить только результаты итальянских исследователей, которые говорят только о единичном случае ее регистрации в когорте из 37 пациентов, что составило менее 3% [12]. Наше исследование показывает значительно более высокую частоту встречаемости экспрессии RET (27,08%) у пациентов со злокачественными новообразованиями слюнных желез.
Заключение
Основываясь на полученных нами результатах, разумно предположить, что уровень экспрессии мРНК гена RET возможно использовать не только как фактор, говорящий об активации данного киназного пути и об агрессивности опухолевого процесса, но и как возможный предиктор эффективности использования данной когортой пациентов таргетных препаратов, относящихся к группе мультикиназных ингибиторов. Однако подтверждение данного факта требует проведения проспективных клинических исследований.
