Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови беременной женщины (НИПС) получает все более широкое распространение во всем мире. При проведении НИПС могут применяться два подхода к определению риска наличия анеуплоидий. Первый подход полногеномный, с применением высокопроизводительного секвенирования для прочтения всего генома целиком. Второй – таргетный, при котором с помощью высокопроизводительного секвенирования, микрочипов или цифровой ПЦР исследуются только отдельные фрагменты генома. При использовании первого, полногеномного подхода, представляется возможность выявлять не только риск наличия частых анеуплоидий (под частыми подразумеваются трисомии по 21, 18 и 13-й хромосомам, а также нарушения числа копий половых хромосом), но и анеуплоидий по другим аутосомам [1–3]. Проведение преимплантационного генетического скрининга эмбрионов и исследование абортивного материала в случае неразвивающихся беременностей показали, что у эмбрионов человека встречаются анеуплоидии по всем хромосомам [4]. Также по большинству хромосом описаны случаи мозаичной формы анеуплоидий [5]. При этом рождение живых детей с полной формой редких анеуплоидий практически не происходит из-за элиминации нежизнеспособных эмбрионов на ранних сроках беременности. Клиническая значимость выявляемого по данным НИПС высокого риска редкой анеуплоидии не ясна, крупномасштабных исследований, посвященных этому вопросу, не проводилось.
При проведении НИПС исследуется внеклеточная ДНК в плазме крови беременной женщины, которая состоит из внеклеточной ДНК матери и внеклеточной ДНК плода. Источником циркулирующей в кровотоке матери ДНК плода являются клетки плаценты, кариотип которых не всегда совпадает с кариотипом самого плода [6]. При цитогенетических исследованиях получаемого при биопсии ворсин хориона материала, примерно в 1% случаев наблюдается мозаицизм плаценты [1]. В большинстве случаев редких трисомий при наличии плацентарного мозаицизма плод имеет нормальный кариотип, в 2,5% случаев наблюдается однородительская дисомия [7]. Получаемые цитогенетическими методами по результатам исследования ворсин хориона данные позволяют определять мозаицизм при доле трисомных клеток от 5–10%. При проведении НИПС минимальная доля детектируемых трисомных клеток значительно выше – 30–40%, так как в среднем доля плодовой ДНК в крови матери составляет 10%, а заявляемый производителями предел детекции метода 3–4%. В связи с этим, на основании проведенных ранее цитогенетических исследований затруднительно судить о клинической значимости выявляемого при проведении НИПС риска наличия редких анеуплоидий. По данным исследования группы бельгийских ученых, из 15 выявленных по результатам НИПС случаев высокого риска наличия редких анеуплоидий по аутосомам, в 3 случаях наличие анеуплоидных клеток у плода подтверждено с использованием инвазивной диагностики, в одном случае помимо мозаицизма у плода обнаружена однородительская дисомия [1].
Выявление мозаицизма в плаценте может свидетельствовать не только о возможном наличии анеуплоидий у плода. Плацентарный мозаицизм сам по себе способен приводить к задержкам внутриутробного развития плода и осложнениям беременности [8–10].
В данной работе представлено описание 2 клинических наблюдений, в которых по данным НИПС был определен высокий риск анеуплоидии по 7-й хромосоме.
Описание клинического наблюдения № 1
Пациентка А., 35 лет, неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери производился на сроке беременности 17–18 недель. У пациентки первая беременность, наступила после процедуры ЭКО. Основаниями для проведения ДНК-скрининга являлись как старший репродуктивный возраст женщины, так и результаты стандартного скрининга I триместра.
В результате проведенного исследования установлен высокий риск трисомии по хромосоме 7.
Риск анеуплоидий по хромосомам 13, 18, 21, а также по половым хромосомам оценен как низкий, в связи этим было рекомендовано пролонгирование беременности.
Установленный в ходе исследования пол плода – мужской. Доля плодовой ДНК составила 11% (выше 4% – порога чувствительности метода).
Изначально в ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России женщина обратилась для наблюдения за течением беременности. Соматически не отягощена. С ранних сроков беременность протекала на фоне угрозы выкидыша. В сроке 4 недели беременности в связи с кровянистыми выделениями из половых путей проведена терапия, направленная на пролонгирование беременности.
При проведении пренатального скринига 1-го триместра, расчет рисков осуществлялся с помощью программы Astraia. При этом был установлен несколько повышенный индивидуальный риск трисомии по 18-й хромосоме (1:233 при базовом риске 1:934). Показатели биохимических маркеров: β-ХГЧ=0,489 MoM; PAPP-A=0,123 MoM.
В 17 недель беременности угрожающий поздний выкидыш, по УЗИ: полное предлежание плаценты, ретроамниотическая гематома. Была госпитализирована в отделение патологии беременных для проведения терапии, направленной на пролонгирования беременности (гемостатическая, спазмолитическая, гормональная).
В 20 недель беременности по данным УЗИ впервые было выявлено подозрение на мелкий перимембранозный ДМЖП.
В 38 недель беременности при плановом прохождении кардиотокографии (КТГ) – выраженное нарушение состояния плода, показатель состояния плода – 2,79. Было проведено УЗИ и допплерометрия: синдром задержки роста плода (СЗРП). Полное отсутствие околоплодных вод. Нарушение кровотока в артериях пуповины II степени. Предполагаемая масса плода 2210 г.
В связи с нарушением состояния плода по данным КТГ, допплеромтерии, СЗРП 2-й степени, было принято решение об экстренном родоразрешении. Проведена операция: кесарево сечение.
Родился живой доношенный гипотрофичный мальчик массой 2210 г, ростом 48 см, Апгар 8/8 баллов. Объем кровопотери 500 мл.
Исследование плаценты, в том числе с применением молекулярно-генетических методов, не проводилось.
Описание клинического наблюдения № 2
Пациентка М., 39 лет, обратилась для проведения НИПС на сроке беременности 13 недель 6 дней. У пациентки 2-я беременность. Основанием для проведения ДНК-скрининга являлся старший репродуктивный возраст женщины. В результате проведенного исследования установлен высокий риск трисомии по хромосоме 7. Риск анеуплоидий по хромосомам 13, 18, 21, а также по половым хромосомам оценен как низкий, в связи этим было рекомендовано пролонгирование беременности. Установленный в ходе исследования пол плода – женский. Доля плодовой ДНК составила 8% (выше 4% – порога чувствительности метода).
Изначально в НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова женщина обратилась для наблюдения за течением беременности. Соматически не отягощена. Первая беременность в 2003 году протекала без осложнений, завершилась своевременными оперативными родами (тазовое предлежание), родился живой доношенный мальчик 3340/51 см, Апгар 8/9 баллов.
Данная беременность вторая, наступила самопроизвольно. С ранних сроков беременности было диагностировано низкое расположение плаценты (доходит до области внутреннего зева), краевое прикрепление пуповины. Был проведен пренатальный скриниг I триместра, все показатели в пределах нормы, риск хромосомной патологии плода оценен как низкий.
С 23 недель беременности был диагностирован гестационный сахарный диабет, назначена диетотерапия. В 25 недель беременности установлен диагноз железодефицитная анемия средней степени тяжести (Hb – 83 г/л), была проведена антианемическая терапия препаратами железа.
В III триместре беременность осложнилась угрожающими преждевременными родами, в связи с появлением кровянистых выделений из половых путей была госпитализирована, проведена гемостатическая терапия, гормональная терапия микронизированным прогестероном, проведена профилактика респираторного дистресс-синдрома плода. С 29 недель беременности отмечено умеренное маловодие.
В дальнейшем – течение беременности без осложнений. В связи с наличием краевого предлежания плаценты и рубца на матке после предыдущей операции кесарева сечения в 2003 году, в сроке 39 недель проведена операция: кесарево сечение. Родилась живая доношенная девочка массой 2838 г, ростом 48 см, Апгар 8/9 баллов. Объем кровопотери 800 мл.
Макроскопическое описание плаценты. Общая масса последа после отделения пуповины и амниотических оболочек 398 г (< 10-й перцентили), малая для гестационного срока плацента. Размеры плацентарного диска -18х17х2 см. Форма плаценты – правильная. Плодная поверхность фиолетового цвета, блестящая, наложений нет. Материнская поверхность синюшно-красного цвета, блестящая, наложений нет. Межворсинчатое пространство полнокровное. Пуповина: длина 27 см, диаметр 0,5 см, прикрепление краевое.
Извитость пуповины, витков: 12. 1 ложный узел. (Индекс извитости пуповины 0,44). Плодные оболочки серовато-розового цвета, блестящие, наложения желтые, точечные. Количество вырезанных блоков (кусочков) 4.
Микроскопическое описание плаценты. Пуповина: строение правильное, артерии и вены спавшиеся, воспалительных изменений нет.
Оболочки: воспалительных изменений нет.
Хорион: в строении ворсинчатого дерева преобладают зрелые промежуточные ворсины, количество полноценно капилляризованных терминальных ворсин 15–20%; единичные незрелые промежуточные ворсины ограничены небольшими участками. Строма большинства стволовых ворсин фиброзирована. Балльная оценка – 21 (норма 22). Отставание созревания ворсинчатого дерева на 2–3 недели. Умеренно выраженные компенсаторные процессы в виде синцитиальных почек (++), синцитиокапиллярные мембраны в небольшом количестве (+). Дистрофические процессы умеренно выражены: десквамация синцитиотрофобласта (+). Плодный фибриноид (++). Дистрофическое обызвествление (+++). Очаговые некрозы базальной пластинки (++). Старые и свежие инфаркты ворсинчатого дерева с очагами обызвествления и свежими кровоизлияниями. Воспаления нет.
Патологогистологическое заключение (диагноз). Малая для гестационного срока плацента. Замедленное созревание ворсинчатого дерева. Компенсированное состояние плаценты. Старые и свежие инфаркты ворсинчатого дерева. Краевое прикрепление и гиперизвитость пуповины (индекс извитости 0,44).
Код диагноза МКБ-10: [O43.8] Другие плацентарные нарушения.
Цитогенетическое исследование плаценты. Исследование производили методом FISH, с применением зондов Poseidon DNA Probes SE 7 (D7Z1), green (производства фирмы Kreatech, Нидерланды). Исследовался биоптат плодовой части плаценты, полученный из 4 сегментов: верхний левый, нижний левый, нижний правый и верхний правый сегменты. Ниже представлены полученные результаты по отдельным сегментам.
1) верхний левый сегмент
nuc ish 7(D7Z1×2)[120]/7(D7Z1×3)[71]/7(D7Z1×4 [9]
– 60% – 3 сигнала, 35% – 2 сигнала, 5% – 4 сигнала.
Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 60% клеток.
2) нижний левый сегмент
nuc ish 7(D7Z1×2)[165]/7(D7Z1×3)[35]
– 82% – 2 сигнала, 18% – 3 сигнала.
Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 18% клеток.
3) нижний правый сегмент
nuc ish 7(D7Z1×2)[189]/7(D7Z1×3)[11]
– 95% – 2 сигнала, 5% – 3 сигнала
Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 5% клеток.
4) верхний правый сегмент
nuc ish 7(D7Z1×2)[131]/7(D7Z1×3)[69]
– 65% – 2 сигнала, 35% – 3 сигнала
Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 35% клеток.
В качестве контроля взята кровь нормальной здоровой женщины, исследовались 200 клеток, сигналов с трисомией по 7-й хромосоме не выявлено.
Цитогенетическое исследование ребенка. Проведено исследование стандартного кариотипа ребенка пациента М. по периферической крови новорожденной девочки. Установлен нормальный кариотип 46,ХХ в 30 клетках. Дополнительно произведено исследование крови ребенка методом FISH по 7 хромосоме: 46,ХХ.ish 7(D7Z1×2)[200]. То есть во всех 200 исследованных клетках выявлена дисомия по 7-й хромосоме (норма).
Обсуждение
У обеих женщин диагностировано предлежание хориона и в последующем – краевое прикрепление плаценты. В обоих случаях беременность протекала с явлениями угрозы прерывания, маловодия.
Обе женщины родоразрешены при доношенном сроке беременности. В обоих случаях родились живые доношенные дети с низкой массой тела. У пациентки А. было проведено кесарево сечение в связи с внутриутробной гипоксией и нарушением фето-плацентарного и маточно-плацентарного кровотока. Масса ребенка 2210 г, длина 48 см. Вторая женщина родоразрешена в плановом порядке. Масса ребенка 2848 г, длина 48 см.
Наличие мозаицизма по трисомии хромосомы 7 в плаценте у пациента М. доказано с применением молекулярно-цитогенетического метода.
В настоящее время во всем мире и в нашем Центре в частности большое распространение получили методы детекции анеуплоидий в эмбрионах до их имплантации в полость матки в ходе проведения программ экстракорпорального оплодотворения (предимплантационный генетический скрининг, или ПГС). Чаще всего данный подход основан на полногеномном анализе ДНК биоптата трофоэктодермы эмбрионов 5–6 суток развития. Выявление в данном биоматериале анеуплоидий во всех или в части исследуемых клеток (хромосомный мозаицизм) является основанием для исключения данного эмбриона из цикла ЭКО. Вместе с тем, описанные выше клинические случаи дают основание полагать, что выявление хромосомной аномалии в биоптате трофоэктодермы не может быть абсолютным показанием для исключения эмбриона из цикла ЭКО, так как подобные дефектные клетки могут впоследствии принять участие в формировании плаценты, а не плода, что не повлияет на его дальнейшее развитие и рождение здорового ребенка.
Изолированная хромосомная патология, включающая редкие анеуплоидии и выявляемая при проведении полногеномного неинвазивного ДНК-скрининга, может свидетельствовать о наличии анеуплоидии в клетках плаценты и приводить к нарушению плацентации. Высокий риск наличия редкой анеуплоидии по данным НИПС может служить предиктором осложненного течения беременности и поэтому должен учитываться при выработке тактики ведения беременной женщины.
