Кишечные инфекционные заболевания имеют высокую социально-экономическую значимость и продолжают оставаться актуальной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с высокой заболеваемостью, смертностью, трудностями диагностики, а также триггерным действием на
развитие патологических синдромов, иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояний. В структуре инфекционной патологии острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают одно из ведущих мест [1].
Полиэтиологичность большинства ОКИ и присутствие у возбудителей широкого спектра антигенов, токсинов и ферментов обусловливают одновременное или последовательное воздействие на организм человека нескольких факторов патогенности с различными механизмами действия [2–5]. Наиболее мощным эффектом среди них обладают липополисахариды, сходные с ними по действию компоненты грамположительных возбудителей, а также экзотоксины.
Особенности воздействия возбудителей и их факторов патогенности (отдельных и в совокупности) на макроорганизм в конкретных условиях инфекционного заболевания изучены недостаточно в связи с ограниченными возможностями используемых методов, их сложностью и малой доступностью. В современных условиях все большую значимость приобретает необходимость понимания того, каким образом энтеропатогенные возбудители способны вызывать развитие заболеваний и влиять на характер клинического течения, в т. ч. микстинфекций, в условиях формирования и распространения клонов возбудителей с полирезистентностью к антимикробным препаратам, постоянного изменения этиологической структуры, роста числа смешанных бактериально-бактериальных, бактериально-вирусных инфекций и необходимости более осторожного и дифференцированного подхода к вопросам лечения и профилактики.
В связи с этим несомненный интерес представляет изучение экзотоксинов в биосредах организма больных при кишечных инфекционных заболеваниях, а именно – их присутствия, уровня и динамики, соотношений с выраженностью синдрома интоксикации, уровнями иммунных комплексов, спектром, уровнями, динамикой про- и противовоспалительных цитокинов, другими факторами клеточного, а также гуморального иммунного ответа.
Цель работы – выявление маркеров токсинов кишечных бактерий у больных ОКИ для диагностики и оценки эффективности лечения.
Материал и методыисследования
Проведено клинико-лабораторное обследование 273 больных ОКИ различной этиологии средней тяжести течения. В остром периоде заболевания бактериологическое подтверждение диагноза получено у 14,7 % пациентов: у 12,5 % обнаружены сальмонеллы, у 2,2 % – шигеллы, у остальных 85,3 % больных диагноз бактериологически не подтвердился (БПОНЭ – бактериальное пищевое отравление неустановленной этиологии). Исследования проведены в остром периоде (1–3-й дни), в динамике болезни (4–6-й дни) и в период ранней реконвалесценции (7–9-й дни).
В качестве дополнительного метода расшифровки этиологии ОКИ мы использовали реакцию коагглютинации (РКА) на стекле с набором антительных диагностикумов для выявления в качестве маркеров возбудителей О-антигенов (О-АГ) S. sonnei, S. flexneri 1–6, S. dysenteriae 1, Salmonella В, С1,
С2, D, E серогрупп, Y. pseudotuberculosis І и ІІІ, Y. enterocolitica О3, О7,8, О9, О4, 33, О6, 30, Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari), V. сholerae 01, а также РКА на планшете для выявления маркеров Шига токсина (ШТ), токсинов А и В C. difficile, энтеротоксина типа А C. perfringens, холероподобного энтеротоксина (диагностикумы были изготовлены и любезно предоставлены ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН). Выявление маркеров токсинов проведено в пробах копрофильтратов (КФ) и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), осажденных из сыворотки крови с использованием 5 %-ного полиэтиленгликоля 6000 [6–8].
Количественное содержание интелейкина-1β (ИЛ-1β), фактора некроза опухоли (ФНО) α, ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови определено у 180 больных в разгар заболевания иммуноферментным анализом (тест-системы ООО “Протеиновый контур” СПб.). Также проведены традиционные бак-
териологические исследования, общеклинические анализы крови и мочи, по показаниям – копрологическое и биохимические исследования, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, гастроскопия, колоно-, ректороманоскопия и ЭКГ.
С целью оценки основных объективных симптомов интоксикации и диарейного синдрома учитывали максимальную высоту и длительность лихорадки, частоту стула и общую длительность диареи, а также количество лейкоцитов и лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) в разгар болезни (1–3-й дни).
Статистическая обработка данных была выполнена по программам Microsoft Excel и Statistica 6.0, “Biostat” для IBM PC. Использованы параметрические и непараметрические критерии-χ2 Стьюдента, корреляционный анализ.
Результаты и обсуждение
Этиологическая структура ОКИ (n = 273) подтверждена в общей сложности бактериологически и по выявлению О-АГ, а также маркеров токсинов возбудителей у 94,9 % больных: у 11,0 % выявлен О-АГ одного возбудителя либо маркер одного токсина клостридий, т. е. диагностирована моноинфекция, у 229 (83,9 %) установлено смешанное инфицирование (микст-АГ), у остальных (5,1 %) пациентов этиология заболевания не выявлена.
В целом О-АГ разных кишечных возбудителей выявлены в парных пробах КФ (в разгар заболевания и в период ранней реконвалесценции) в 90,1 % случаев, в виде моно-О-АГ – в 9,9 %, микстО-АГ – в 18,7 %, в сочетании с токсинами – в 61,5 %. О-АГ S. dysenteriae 1 и V. сholerae 01 найдены не были.
Маркеры токсинов в условно принятом нами диагностическом титре 1 : 8 были найдены всего у 67,8 % больных. Маркеры ШТ найдены в 24,4 % проб КФ, токсина А C. difficile – в 29,4 %, токсина В C. difficile – в 23,2 %, энтеротоксина А C. perfringens – в 32,9 % и холероподобного энтеротоксина
(ХЭТ) – в 12,1 % проб КФ. Достоверно чаще были выявлены токсины А C. difficile и C. perfringens (р < 0,05), реже – ХЭТ (р < 0,05) в сравнении с остальными токсинами. У 16,5 % больных титры токсинов были очень высокими (1 : 512 и выше). Частота одновременного выявления 3 и более маркеров токсинов в одной пробе КФ составила 46,5 %. В основном (66,7 %), выявлены различные сочетания токсинов А и/или В C. difficile с А C. perfringens и/или ШТ (в сочетании с токсинами клостридий – у 64,5 %). К моменту выписки из стационара (6–10-й дни болезни) у 34 больных в кале сохранялись АГ токсинов клостридий в повышенном титре (12,5 %).
Таким образом, очевидно преимущество метода РКА для этиологической расшифровки ОКИ. Так, если по данным бактериологического исследования этиология заболевания была установлена у 14,7 % больных, при определении О-АГ или маркеров токсинов с использованием РКА в результате исследований двух проб КФ подтверждение диагноза получено в 94,9 % случаев.
Сравнительный анализ симптомов интоксикации и диареи в зависимости от присутствия у них моно- или микстмаркеров токсинов и О-АГ возбудителей показал, что высота температуры в сравниваемых группах достоверно не различалась, лихорадка была несколько длительнее при воздействии миксттоксинов (р > 0,05). Частота стула в группе больных с монотоксином в разгар болезни была достоверно выше, чем в группах с микст-токсинами и сочетанием токсина C. perfringens А с О-АГ (5,9 ± 0,9; р < 0,05). Диарея была длительнее в группе больных с микст-О-АГ (р > 0,05). Интересен тот факт, что максимальное значение ЛИИ выявлено в группе с маркерами разных токсинов (35,3 ± 19,4), что достоверно выше, чем при сочетанном влиянии токсинов и О-АГ разных возбудителей (р < 0,03; табл. 1).
Таблица 1. Клинико-лабораторные особенности течения ОКИ при наличии токсинов и/или О-АГ.
Детальный анализ показателей диарейного синдрома (боли в области живота, характер стула и присутствие в нем патологических примесей) показал, что во всех группах больных чаще отмечаются обильный водянистый стул (р < 0,05), боли в животе различного характера и интенсивности, однако более яркие проявления колита и гемоколита отмечены при микст-О-АГ и их сочетании с токсинами (табл. 2).
Таблица 2. Характер диарейного синдрома в зависимости от присутствия токсинов и/или О-АГ.
Мы полагаем, что выявление маркеров токсинов клостридий даже в небольших титрах должно привлекать к себе внимание, т. к. свидетельствует о присутствии в кишечнике этих токсинпродуцирующих бактерий, способных при благоприятных условиях (нарастание дисбиоза, антибиотикотерапия и др.) быстро увеличивать продукцию токсина с возможным развитием псевдомембранозного колита [4].
ШТ считается наиболее распространенным токсином, встречающимся у S. dysenteriae 1 и их О–-мутантов, S. flexneri различных сероваров, кроме VІ, E. coli, сальмонелл и йерсиний псевдотуберкулеза, V. cholerae, V. parahaemolyticus, A. haemolyticus [9–13].
ХЭТ вырабатывается E. coli, представителями родов Escherichia, Salmonella, Campylobacter, Aeromonas, Vibrio. Продукция этих токсинов (ШТ и ХЭТ) может быть обусловлена также энтеробактериями, относящимися к группе условнопатогенных бактерий, исследования на наличие которых у взрослых больных проводятся редко (K. oxytoca, C. freundii, K. pneumoniae, E. cloacae, E. aerogenes spp. и др.) [14–15].
Впервые у больных ОКИ нами была изучена динамика изменений уровней в каждый из изучаемых периодов болезни маркеров ряда наиболее значимых токсинов, выступающих в качестве важных факторов патогенности в развитии кишечных инфекций, – ШТ, токсинов А и В C. difficile, энтеротоксина типа А C. perfringens и ХЭТ.
Детальное изучение динамики выявления маркеров токсинов в КФ свидетельствует о высокой частоте их выявления начиная с первых дней от начала заболевания с последующим снижением к ранней реконвалесценции, достоверным для C. perfringens А и ШТ (р < 0,05). Частота выявления всех токсинов в 1–3-й дни болезни была также выше, чем в последующие сроки исследования. На 4–6-й день АГ C. perfringens А выявлен достоверно чаще, чем ШТ и C. difficile (р < 0,05).
Максимальные уровни ШТ и токсина А C. perfringens были выявлены уже в первый день болезни, токсинов А и В C. difficile – на 2-й и только ХЭТ – на 3-й день. В динамике заболевания начиная с 4-го дня средние уровни маркеров всех токсинов снижались. В период ранней реконвалесценции (на 7–9-й дни) наблюдалось достоверное снижение уровня ШТ (р < 0,01), ХЭТ (р < 0,05), токсинов А C. perfringens и C. difficile (р < 0,05), кроме токсина В C. difficile.
Однако к моменту выписки из стационара АГ ШТ (4,0 %), ХЭТ (2,2 %) и токсинов клостридий (12,5 %) еще сохранялись в кале в диагностическом титре. Основываясь на предварительном анализе, при рассмотрении результатов определения цитокинов в сыворотке крови мы разделили всех пациентов на несколько групп в зависимости от выявленных уровней ИЛ-4 (табл. 3). В первую группу вошли больные с концентрациями ИЛ-4 от 0 до 4,9 пг/мл, во вторую – 5,0–29,9, в третью – 30,0–100,0 и в четвертую – 500,0 пг/мл и выше.
В этих группах больных, сформированных по уровню ИЛ-4, при анализе уровней и динамики токсинов, антигенной “нагрузки”, показателей ЛИИ и числа лейкоцитов, отмечены следующие тенденции. При подпороговых концентрациях ИЛ-4 (группа 1) уровни всех токсинов практически не изменялись в динамике заболевания. При сочетании ИЛ-4 с ИЛ-1β и ФНО-α в диагностических концентрациях их средние уровни колебались в небольшом диапазоне и имели тенденцию к понижению.
Более высокие средние концентрации ИЛ-4 наблюдались в группе 4 с достоверным преобладанием у больных числа проб с ростом титров токсинов над числом проб с падением титров токсинов; кроме того, отмечено снижение числа лейкоцитов в периферической крови (р < 0,02) и увеличение показателя ЛИИ, превысившее нормальные показатели уже при концентрации ИЛ-4 выше 30 пг/мл (р < 0,04), а также достоверное повышение уровней ИК в динамике заболевания (р < 0,05). При одинаковой “нагрузке” О-АГ (число выявленных О-антигенов разных возбудителей в
расчете на одну пробу копрофильтрата) токсическая “нагрузка” в группе с подпороговыми уровнями ИЛ-4 (5,0–29,9 пг/мл) растет, а в группе с уровнем ИЛ-4 свыше 500,0 пг/мл и высоких уровнях других цитокинов – падает (р < 0,05).
При анализе динамики уровней среднемолекулярных ИК в КФ в зависимости от периода заболевания в общей группе больных отмечено достоверное их нарастание к 4–6-му дню заболевания и в период реконвалесценции (7–9-й дни) по сравнению с 1–3-м днями (р < 0,02), однако в выделенных группах изменение уровней ЦИК в КФ было различным (табл. 3).
Таблица 3. Сравнительный анализ некоторых лабораторных показателей в группах больных с различными уровнями ИЛ-4.
С учетом того что с увеличением числа проб с ростом титров токсинов наблюдалось увеличение концентраций ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-4 в крови больных, а высокий уровень ИЛ-10 установлен только при концентрации ИЛ-4 выше 500 пг/мл, представляло интерес проследить корреляции различных уровней ИЛ-4 с другими ЦК. Оказалось, что уровни ИЛ-4 повышались с увеличением числа обнаруживаемых цитокинов (табл. 4).
Таблица 4. Уровни цитокинов и корреляции между ними в зависимости от их профиля.
При одновременном выявлении ИЛ-4 и ИЛ-1β корреляция их уровней была прямой и достоверной, а ИЛ-4 с ФНО-α –недостоверной. При высоких уровнях ИЛ-4 и ИЛ-1β отмечены достоверная корреляция ИЛ-4 со всеми цитокинами и отсутствие корреляции ИЛ-10 с ИЛ-1β, т. е. создавалось впечатление, что именно ИЛ-4 выступает в качестве “сторожевого” маркерного цитокина, умеренный уровень которого отражает присутствие провоспалительных цитокинов (ФНО-α и ИЛ-1β), а высокий уровень – присутствие противовоспалительного ИЛ-10.
В целом средние уровни маркеров токсинов в составе ЦИК сыворотки крови в течение заболевания имели монотонный характер. При этом только в отношении маркера ШТ была установлена достоверная прямая корреляция его уровня в составе ЦИК в период ранней реконвалесценции (4–7-й дни болезни) с уровнем маркера ШТ в КФ в разгар болезни (1–4-й дни болезни; r = 0,23, р = 0,005).
Представлял интерес анализ полученных данных с точки зрения влияния токсигенной нагрузки в организме (числа одновременно присутствующих в КФ маркеров токсинов без учета липополисахаридов) на уровни маркеров токсинов в составе ЦИК крови.
В результате такого анализа установлено, что титры маркера ТШ в ЦИК были достоверно выше в присутствии двух токсинов в кале, чем в присутствии одного токсина, а при трех и четырех – уровни маркера ШТ в ЦИК достоверно снижались. Похожая картина наблюдалась и при выявлении маркера токсина А C. difficile в составе ЦИК. При этом уровни маркеров остальных токсинов практически не зависели от числа токсинов в КФ. Общий уровень ЦИК был наиболее низким у больных с двумя-тремя токсинами в кале (табл. 5).
Таблица 5. Уровни маркеров токсинов в ЦИК в зависимости от токсигенной нагрузки в КФ (lg10 обратного титра маркера).
Это свидетельствовало о том, что увеличение токсигенной нагрузки негативно сказывается на продукции специфических антитоксических антител и, соответственно, на связывании ими токсинов возбудителей в ЦИК. Изучение частоты выявления маркеров токсинов возбудителей в составе
ЦИК у больных ОКИ на фоне лечения ципрофлоксацином (64 пациента) и без такового (76 пациентов) показало, что частота обнаружения их в составе ЦИК сыворотки крови в титре ≥ 1 : 4 была в группах практически одинаковой. При этом наиболее часто выявлялся маркер ШТ (84 и 86 %), реже – маркеры других токсинов (C. perfringens – 70 и 63 %, В C. difficile – 48 и 58 %, А C. difficile – 13 и 22 %, ХЭТ – 5 и 8 % соответственно). По отдельным дням болезни достоверных различий между группами частоте выявления маркеров токсинов не отмечено. Это свидетельствовало об отсутствии выраженного влияния ципрофлоксацина на частоту выявления маркеров токсинов в ЦИК, т. е. на частоту формирования специфических антитоксических ЦИК у больных ОКИ.
При исследовании уровней маркеров токсинов в составе ЦИК сыворотки крови у больных ОКИ установлено, что в целом вне связи с проводимым лечением в разгар заболевания (3–4-й дни болезни) титры маркера ШТ были наиболее высокими и позже практически не снижались, несколько ниже были титры маркера токсина C. perfringens, достоверно ниже – титры маркера токсина В C. difficile, а маркеры токсина А C. perfringens и ХЭТ практически не определялись.
Достоверные различия между группами отмечены по уровню маркера ШТ: выше – при обследовании на 5-й день болезни (р = 0,01), ниже – на 7-й день болезни и позже (р = 0,04) в 1-й группе больных, леченных ципрофлоксацином, по сравнению со 2-й группой больных без такового. Кроме того, уровни маркера токсина В C. difficile в 1-й группе на 5-й день болезни были достоверно ниже, чем на 3–4-й и 6-й дни, а во 2-й группе они достоверно увеличивались в течение первых 6 дней болезни.
Это указывает на то, что при лечении ОКИ ципрофлоксацином существует тенденция к росту уровня маркера ШТ в ЦИК, а при терапии без данного препарата – к падению указанного показателя. Кроме того, отмечаются более высокие уровни маркера токсина В C. difficile в составе ЦИК к концу 1-й недели болезни.
На фоне лечения ципрофлоксацином происходила быстрая элиминация О-АГ возбудителей при исследовании КФ, но при этом происходило усиление образования Шига-специфических ЦИК, что, возможно, обусловлено увеличением продукции ШТ в кишечнике. Как свидетельствуют литературные
данные [16], хинолоновые препараты воспринимаются микроорганизмом как стресс-фактор и в ответ на это он начинает усиленно передавать ген шигаподобного токсина другим микробам, в т. ч. из состава нормальной флоры кишечника, с последующим увеличением продукции токсинов данной
группы. При этом высокие уровни шигаподобных токсинов в кале больных рассматриваются в качестве предиктора развития гемолитико-уремического синдрома [17].
Выводы
1. У больных ОКИ О-АГ шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза І и ІІІ, энтероколитика О3, О7, 8, О9, О4, 33, О6, 30 и кампилобактерий выявлены в 90,1 %, а в сочетании с токсинами – в 61,5 % случаев, что значительно превышает диагностические возможности бактериологического исследования. К моменту выписки из стационара маркеры токсинов сохранялись в кале у 12,5 % больных.
2. В разгар ОКИ отмечены наиболее высокие уровни маркеров ШТ, токсина А C. difficile и C. perfringens, более низкие – токсина В C. difficile и ХЭТ. Уровни маркеров токсинов коррелировали между собой (r = 0,32–0,89, р < 0,01) и частотой их выявления; в динамике заболевания они снижались.
3. Сочетанное присутствие у больных О-АГ и маркеров токсинов нескольких возбудителей сопровождается более выраженными клиническими проявлениями болезни (длительная и частая диарея, лихорадка, сильный болевой синдром, появление патологических примесей в стуле) и высо-
ким ЛИИ в сравнении с больными, у которых обнаружен маркер одного токсина.
4. С целью верификации диагноза ОКИ, выявления микст-инфекций и труднодиагностируемых заболеваний (йерси-ниозы, кампилобактериозы, клостридиозы) целесообразно использовать широкий спектр диагностических тестсистем для выявления маркеров экзотоксинов (ШТ токсина, энтеротоксинов А и В C. difficile, энтеротоксина А C. perfringens, ХЭТ) и О-АГ (шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза І и ІІІ, а также энтероколитика О3, О7, 8, О9, О4, 33, О6, 30, кампилобактерий).
5. При увеличении токсигенной нагрузки на организм (до трех-четырех токсинов в кале) происходит снижение уровней маркеров ШТ и токсина А C. difficile в составе ЦИК.
6. При лечении ОКИ ципрофлоксацином существует тенденция к росту, а при лечении без использования ципрофлоксацина – к падению уровня маркера ШТ в составе ЦИК крови. Полное прекращение выявления в КФ О-АГ и токсинов может служить показателем высокой эффективности
проведенного лечения.
