На сегодняшний день только трансплантация печени признана эффективным методом радикального лечения декомпенсированных форм печеночной недостаточности (ПН) [1–3], которая, однако, из-за повсеместно существующего дефицита донорских органов не может быть выполнена всем нуждающимся больным. В ситуации постоянно возрастающей нехватки донорских органов, с одной стороны, и констатируемого снижения восстановительных процессов (пролиферативной активности гепатоцитов) в поврежденной печени, с другой особенно при достижении в ней критической массы паренхимы, наши усилия способствовали разработке нового направления в гепатологии – регенерационной клеточной терапии, призванной активизировать сохранившиеся резервы восстановительной регенерации в поврежденной печени для устранения дефицита функционально активной ткани.
Сравнительная характеристика активности клеток печени и клеток костного мозга в процессах восстановительной регенерации поврежденной печени
Известно, что при хронических прогрессирующих заболеваниях печени с избыточным разрастанием в ней соединительной ткани у оставшихся гепатоцитов снижается чувствительность к естественным ауторегуляторным регенерационным стимулам. Сниженное участие гепатоцитов в процессах восстановительной регенерации в печени нарушает адекватность выработки в ней регуляторного соотношения вырабатываемых про- и противовоспалительных цитокинов, про- и антифиброгенных факторов (матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов). В результате в печени создаются условия не для осуществления восстановительной регенерации, а для хронически поддерживаемого воспаления и фиброзирования [4, 5].
С целью восстановления угнетенной пролиферативной активности гепатоцитов стали осуществлять трансплантацию или экстракорпоральное подключение аутологичных, аллогенных и даже ксеногенных гепатоцитов [6]. Однако при изучении эффективности активации регенерации паренхимы печени оказалось, что гепатоциты, будучи зрелыми и уже дифференцированными клетками, способными к выполнению специфических функций, в культуре не размножаются, не дедифференцируются (т. е. не омолаживаются) и поэтому после трансплантации не продуцируют в организме полный спектр ростовых гепатотропных факторов и не способны индуцировать эффективную митотическую активность гепатоцитов в поврежденной печени реципиента.
Недостаточная эффективность зрелых гепатоцитов при лечении фулминантной или хронической ПН [7] способствовала росту интереса исследователей к осуществлению восстановительной регенерации в поврежденной печени с помощью незрелых регионарных стволовых/прогениторных клеток (СПК) печени – овальных (внутрипеченочных СПК) и клеток костного мозга (КМ), которые также являются непременными участниками восстановительного морфогенеза печени [8]. Оба типа клеток признаны регионарными СПК печени, т. к. способны экспрессировать гены гепатоцитарных белков, приобретать некоторые функции гепатоцитов и восстанавливать функциональные резервы клеток поврежденной печени [9, 10].
Интенсификации исследований по применению клеток КМ для восстановительной регенерации поврежденной печени способствовали многочисленные наблюдения возможности гемопоэтических и негемопоэтических (мезенхимальных стромальных) СПК КМ (ГСК и МСК соответственно), а также клеток пуповинной крови и крови взрослого человека дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки [11], а также наблюдения, доказывающие появление в печени после введения клеток КМ полноценных гепатоцитов костномозгового происхождения, которые обеспечивают коррекцию моделированной ПН [12].
В современной литературе широко обсуждается вопрос о возможности восстановительной регенерации печени при использовании клеточных технологий за счет не только усиления пролиферации гепатоцитов и восстановления массы паренхимы, но и регресса уже сформировавшегося фиброза [13, 14].
Уже установлены факты антифиброзного действия СПК КМ [15, 16]. Однако не все исследователи признают фибролитический эффект СПК КМ и даже указывают на возможность усиления фиброза при их применении [17]. Можно думать, что диаметрально противоположные результаты воздействия клеточной терапии на процессы фиброзирования в печени могут быть следствием недоучета типа и дозы используемых клеток, а также стадии (степени тяжести и обратимости) фиброзирующего процесса, при котором они применяются.
В работе А.В. Люндупа (2011) показано, что аллогенные донорские МСК при трансплантации животным с хроническим фиброзирующим повреждением печени способны перепрограммировать процессы регенерации в поврежденной печени и предотвращать развитие соединительнотканной ткани в ней, если МСК КМ используются в достаточной дозе и на ранних сроках развития фиброзирования. Полученные результаты позволили автору сформулировать концепцию резорбции соединительной ткани в печени при воздействии МСК, согласно которой для перепрограммирования регенерационного процесса с фиброзирующего на восстановительный в ткани печени должны быть сохранены резервы адаптации (регуляции, регенерации и пролиферации), которые, однако, истощаются на поздних сроках развития патологического (склеротического) процесса [18]. В этой работе указывается на возможность резорбции соединительной ткани в печени, но при условии раннего применения МСК и в терапевтически эффективных дозах. Очевидно, фибролиз в печени при использовании МСК наступает в результате сопряженного изменения экспрессии матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов [19], т. к. известно, что распад коллагенов и ремоделирование экстрацеллюлярного матрикса осуществляются с их участием.
Результаты применения клеток костного мозга в клинике при остром и хроническом повреждении печени
В настоящее время в различных клиниках мира пока на ограниченном контингенте больных с тяжелой ПН проводятся исследования по оценке эффективности применения аутологичных клеток КМ: изучаются разные популяции клеток (ГСК и МСК) и их дозы, способы доставки клеток в печень, а также сроки и кратность введения их больному [20–27]. В большинстве этих исследований были получены обнадеживающие результаты коррекции клинических и морфологических проявлений ПН, что позволило авторам этих работ считать применение клеток КМ безопасным и эффективным методом коррекции наиболее тяжелых стадий развития ПН. Например, в работе Gordon и соавт. (2006) 5 пациентам с циррозом печени вводили ГСК СD34+ либо через печеночную артерию, либо через портальную вену, и было установлено улучшение функции печени (снижение показателей цитолиза и билирубина; увеличение синтетической функции печени, исчезновение симптомов портальной гипертензии) [28]. Аналогичный путь введения (обычно вводят в портальную вену под ультразвуковым контролем) стволовых клеток использован и другими авторами [29].
Levicar и соавт. (2008) сообщили об успешном лечении пациентов с циррозом печени путем внутриартериального или внутрипортального введения CD34+ стволовых клеток КМ. Эффект от проведенного лечения сохранялся на протяжении 12 месяцев [30].
Lorenzini и соавт. (2008) проанализировали результаты лечения 18 пациентов с циррозом печени путем введения стволовых клеток. Наблюдался хороший клинический эффект. Лечение хорошо переносилось всеми пациентами, и никаких серьезных побочных эффектов зарегистрировано не было. Авторы утверждают, что лечение стволовыми клетками эффективно для пациентов с циррозом печени [31].
Houlihan и соавт. (2008) проанализировали клинические результаты клеточной терапии заболеваний печени в 5 странах на основании 11 публикаций. В обзоре автор критически исследует ключевые вопросы использования стволовых клеток КМ для лечения заболеваний печени: определяет цели терапии СПК, выбор типа клеток для терапии; прослеживает путь и фенотип клеток после их введения, которые предопределяют конечные результаты таких клинических испытаний. На основании анализа автор констатирует безопасность применения СПК КМ для лечения хронических болезней печени. Очень важно, считает автор, чтобы в будущих клинических испытаниях использовались разные типы СПК для лечения конкретных осложнений заболеваний печени [32].
Ismail и соавт. (2009) сообщили о результатах лечения клетками КМ 20 пациентов (18 мужчин и двух женщин, средний возраст – 46 лет) с циррозом печени с гепатоцеллюлярной карциномой. Всем пациентам была произведена резекция опухоли. Наблюдение составило 12 недель после резекции. Авторы отметили, что группа, получавшая в предоперационном периоде СПК, показала значительное улучшение по всем параметрам функции печени и не имела никаких послеоперационных осложнений по сравнению с группой, получавшей плацебо (в этой группе никаких улучшений в параметрах функции печени не отмечено и имели место послеоперационные осложнения). Авторы констатируют, что использование СПК КМ в качестве внешнего источника поддержки пациентов с циррозом печени в предоперационном периоде является эффективным методом клеточной терапии [33].
Интересным следует считать публикацию Furst (2007), в которой автор применяет терапию стволовыми клетками перед предстоящей резекцией печени. Автор констатировал, что введение стволовых клеток в рамках подготовки перед обширной резекцией печени приводит к 2,5-кратному увеличению левого латерального сегмента по сравнению с пациентами, которым стволовые клетки не вводились [29, 34]. Эта методика имеет большой потенциал при обширных резекциях печени [35].
Так, Gasbarrini и соавт. (2007) [36] сообщили о позитивных результатах внутрипортального введения несортированных аутологичных клеток КМ для спасения 67-летнего больного тяжелым токсическим (лекарственным) гепатитом, у которого имелись противопоказания к трансплантации печени. Было констатировано быстрое улучшение синтетической и детоксикационной функции печени, причем в биопсийном материале, взятом на 20-е сутки после трансплантации, отмечено увеличение пролиферации гепатоцитов вокруг очагов некроза, которое авторы связали с паракринным иммуномодулирующим эффектом введенных клеток.
Уже накоплено достаточно клинических наблюдений, свидетельствующих о том, что при хроническом фиброзирующем повреждении печени аутологичные, аллогенные и ксеногенные ГСК и МСК способны оказывать восстановительное воздействие на структуру и показатели функции поврежденной печени [37–43].
Knoefel и соавт. (2005) после внутрипортальной инфузии аутологичных МСК CD133+ больным с эмболизацией портальной вены в результате опухоли печени отметили увеличение пролиферации гепатоцитов в 2,5 раза и коррекцию клинических показателей ПН, что позволило им высказать предположение о высоком терапевтическом потенциале используемых клеток и указать на необходимость дальнейшего изучения возможностей этого метода [44].
Terai и соавт. (2006) сообщили об успешном лечении 9 пациентов с декомпенсированным циррозом печени (В, С по шкале Child–Pugh) путем введения аутологичных СПК КМ: 24 недели спустя отмечено значительное улучшение сывороточного альбумина и общего белка; наблюдалось значительное снижение баллов по Child–Pugh [45].
Lyra и соавт. (2007) опубликовали также обнадеживающие результаты по лечению пациентов с циррозом печени при использовании СПК КМ. Анализ показал, что трансплантация клеток КМ таким больным привела к улучшению синтетической функции печени; исчезновению асцита; улучшению статуса по шкале Child–Pugh [46–47].
Mohamadnejad и соавт. (2007) провели уже 2 группы исследований больных циррозом печени, в которых сравнивалась терапевтическая эффективность аутологичных МСК (I группа) в дозе 31,73 × 106 клеток, и аутологичных ГСК (II группа) в дозе 5,25 × 106 клеток при введении их в печеночную артерию. Оказалось, что из 4 больных I-й группы у 2 через 12 месяцев наступило достоверное улучшение состояния, оцениваемое по клиническим шкалам более чем в 2 раза, тогда как во II группе (n = 4) позитивные изменения по тем же критериям к тому же сроку наблюдения были незначительными. Эти результаты позволили авторам считать, что применение МСК для коррекции печеночной недостаточности в дозах, в 6 раз более высоких, чем дозы ГСК, может оказаться более эффективным, чем применение ГСК. Эти результаты позволяют также прийти к заключению, что МСК, имеющие мезенхимальное происхождение, обладают более высоким потенциалом регуляции регенераторных процессов не только в гепатоцитах, но и в непаренхиматозных синусоидальных клетках – важных участниках восстановительного морфогенеза печени [48, 49].
А.П. Киясов и соавт. (2008) сообщают о позитивных изменениях в клиническом состоянии 3 больных с хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза после однократного введения ГСК в чревный ствол [16]. По результатам пункционной биопсии печени эти авторы уже через месяц после клеточной терапии констатировали снижение индекса гистологической активности за счет уменьшения выраженности портального воспаления и внутридольковых дегенераций.
Однако самым важным результатом трансплантации, по мнению этих авторов, являются положительные качественные изменения непаренхиматозных структур печени – уменьшение количества миофибробластов (активированных звездчатых клеток – клеток Ито) в паренхиме, разрешение перисинусоидального фиброза – с исчезновением коллагеновых волокон в пространстве Диссе и восстановлением нормального строения синусоидальных капилляров, что в свою очередь сопровождалось снижением напряженности регенераторного ответа паренхимы и восстановлением исходно сниженной функциональной активности гепатоцитов (снижение АЛТ, АСТ, ГГТ и повышение протромбинового индекса).
В 2010 г. H. Salama и соавт. сообщили уже о результатах рандомизированного исследования эффективности КМ в 2 группах больных (n = 140) с терминальной стадией ПН. В 1-й группе (n = 90) лечение осуществлено одновременным введением аутологичных ГСК (CD34+) и МСК (CD133+) в воротную вену; 2-я группа (n = 50) служила контролем. У 54,5 % больных 1-й группы были отмечены нормализация уровня ферментов цитолиза, улучшение синтетической функции печени, исчезновение асцита и энцефалопатии, причем побочные эффекты от проведения клеточной терапии не развивались; в контрольной группе улучшения не наступило; позитивная динамика показателей функции печени и состояния пациентов наступила спустя месяц после проведения клеточной инфузии, причем максимальное улучшение функции печени и состояния больных (повышение качества жизни) статистически достоверно достигалось к 6 месяцам после трансплантации [50–51].
В 2010 г. Stutchfield и соавт. был также проведен сравнительный анализ результатов применения клеток КМ больными с хронической ПН (n = 47), но вызванной разными этиологическими факторами: алкогольным повреждением печени (n = 15), вирусным гепатитом С (n = 10), криптогенным циррозом печени (n = 8), вирусным гепатитом В (n = 7), алкогольным и вирусным гепатитом С (n = 2), алкогольным вирусным гепатитом В (n = 1), аутоиммунным гепатитом (n = 2), первичным билиарным циррозом (n = 1) и хроническим заболеванием печени холестатического генеза (n = 1). Оценка проведена по шкале Child–Pugh, волюметрии печени и по функции печени. Недостаточное количество наблюдений в отдельных группах этого исследования позволило автору прийти к заключению о необходимости продолжения исследований выполнения широкого слепого рандомизированного и контролируемого изучения состояния больных после применения клеточной терапии [52].
Lin и соавт. в 2011 г. сообщили о клиническом применении МСК при лечении молниеносной печеночной недостаточности [53].
В публикации Национального института здоровья США приводятся данные рандомизированных клинических исследований по лечению заболеваний печени клетками КМ [54], которые, по существу, подтвердили безопасность и возможность непосредственного введения СПК КМ для лечения различных заболеваний печени.
Анализ результатов клинических исследований разных групп авторов, в которых наряду с позитивной оценкой приводятся сведения об отсутствии улучшения структуры и функции поврежденной печени, например, при введении МСК в условиях тяжелой ПН [17, 55], позволил Dai и соавт. (2009), Hoogduijn и соавт. (2010), Franquesa и соавт. (2013) сформулировать общие рекомендации [56, 57] для повышения результативности их применения в клинике больными с циррозом печени [15].
Эти авторы рекомендуют:
- использовать фракцию МСК, очищенную от фиброгенных клеток, т. е. только CD133+-клетки, что должно снижать риск прогрессирования фиброза печени. Аналогичная точка зрения содержится в работе А.П. Киясова и соавт. (2008) [16];
- осуществлять возможно более раннее применение МСК, в частности на этапе развитого гепатита В, когда по своим биологическим характеристикам они еще не отличаются от клеток здоровых людей [58] и когда еще в организме не наступило необратимое перепрограммирование работы систем восстановительной регенерации;
- использовать достаточно большой объем клеток (от 1 млрд до минимум 1 млн клеток на 1 кг массы тела больного), чтобы можно было оказать мощное регуляторное (перепрограмирующее) воздействие на оставшуюся паренхиму печени, сохранившиеся непаренхиматозные клетки и измененный внеклеточный матрикс [59];
- считать безопасным при наращивании массы МСК использование не более 3–5 культуральных пассажей, т. к. при этом сохраняется генетическая стабильность культивируемых клеток. Достаточным исходным объемом аспирата КМ для получения необходимого количества клеток может стать объем 10–15 мл [60];
- считать предпочтительным внутривенный способ введения клеток: внутриартериальная и внутрипортальная трансплантация клеток из-за нарушения свертываемости крови у больных ПН должна служить противопоказанием к катетеризации указанных сосудов;
- проводить широкомасштабные двойные слепые клинические исследования, которые должны предшествовать внедрению трансплантации МСК в широкую клиническую практику, в т. ч. и лечения хронической ПН [61].
Заключение
Анализ современного состояния биологических и клинических аспектов применения СПК КМ для лечения заболеваний печени различного генеза и степени тяжести позволяет признать перспективность их применения и целесообразность дальнейшего изучения с целью совершенствования возможностей для регенеративной медицины будущего. Показано, что клетки КМ (ГСК и МСК), будучи клетками иммунной системы, имеют мезенхимальное происхождение и поэтому способны через продукцию цитокинов паракринноиндуцировать процессы регенерации в различных клетках печени, но прежде всего – в непаренхиматозных. Кроме того, этим клеткам присущ высокий пластический потенциал и при соответствующих условиях клетки КМ, прежде всего ГСК, способны экспрессировать гены гепатоцитарных белков, приобретать некоторые функции гепатоцитов и тем самым обеспечивать восстановление функциональных и структурных резервов паренхиматозных клеток поврежденной печени. К достоинствам СПК КМ относится также предпочтительность использования аутологичных клеток, что наряду с легитимностью и доступностью получения делает их применение безопасным. Пластичность и паракринные свойства клеток КМ объясняют широкий интерес исследователей к использованию их для осуществления восстановительной регенерации поврежденной печени, увеличивающей массу паренхиматозной ткани путем как пролиферации гепатоцитов, так и перепрограммирования процессов фиброзирования печени на процессы резорбции в ней соединительной ткани. Между тем опыт экспериментальных и клинических наблюдений показывает, что при использовании СПК КМ, особенно фракции МСК, не всегда удается добиваться стойкой и выраженной резорбции соединительной ткани в поврежденной печени. Именно поэтому в дальнейшем внимание исследователей в области регенеративной медицины должно быть направлено, с одной стороны, на углубленное изучение регуляции процессов фиброзирования – дефиброзирования в печени с помощью различных фракций клеток КМ, с другой – на организацию по разработанным протоколам многоцентровых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических исследований всего спектра эффектов, индуцируемых клетками КМ в организме, для разработки программ и протоколов их эффективного применения.
