Бактериофаги (от слов “бактерия” и греч. phagos – пожирающий; БФ), или фаги, – специфические вирусы бактерий, вызывающие их лизис (разрушение клеток) или изменяющие их свойства. Они впервые были обнаружены микробиологами Ф. Туортом (1915) в Великобритании и Ф. д’Эрелем (1917) во Франции. Однако изучить их морфологию удалось только после изобретения электронного микроскопа.
Биология бактериофагов
Широкое распространение БФ в природе связано с повсеместным распространением их основных хозяев – бактерий. БФ могут поражать не только бактерии, но и грибы, и простейшие, поэтому их также называют фагами. По степени специфичности различают: поливалентные БФ, взаимодействующие с родственными видами бактерий; моновалентные БФ, взаимодействующие с бактериями определенного вида; типовые БФ, взаимодействующие с отдельными типами (вариантами) данного вида бактерий.
БФ состоят из белка – капсида, защищающего один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК, одно или двунитевые). Различают БФ с длинным отростком, имеющие сокращающийся или несокращающийся чехол, а также БФ с короткими отростками, аналогами отростков, без отростков и нитевидные (рис. 1, 2). Размер БФ колеблется от 20 до 800 нм (у нитевидных форм). БФ, имеющие форму сперматозоида, достигают до 200 нм длиной, состоят из хвостового отростка и головки икосаэдрического типа, содержащей нуклеиновую кислоту. Капсид головки и чехол хвостового отростка БФ состоят из полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (головка) или спиральному (отросток) типу симметрии. Хвостовой отросток имеет внутри полую трубку (стержень), через которую при инфицировании нуклеиновая кислота фага проходит из головки в бактерию. Чехол отростка заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити). Базальная пластинка и хвостовые фибриллы участвуют в прикреплении БФ к бактериальной ячейке. Не все БФ имеют базальные пластинки и хвостовые фибриллы. В зависимости от жизненного цикла БФ могут быть вирулентными (литическими) или умеренными.
Вирулентные (литические) БФ для внедрения в бактерию адсорбируются на специфических рецепторах клетки, в т. ч. на липополисахариде, липопротеине, тейхоевых кислотах, протеинах, или даже на пилях. Специфичность рецепторов означает, что БФ может инфицировать только определенные бактерии. Попав в бактерию, БФ репродуцируется, формируя 200–500 фаговых частиц, и вызывает гибель бактерии. Это продуктивный (литический) тип взаимодействия. БФ с сокращающимся чехлом адсорбируются на клеточной стенке с помощью фибрилл хвостового отростка. Чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью ферментов (лизоцима) как бы просверливает оболочку клетки. Через канал трубки БФ нуклеиновая кислота инъецируется из головки в бактериальную клетку, а капсид БФ остается снаружи бактерии (рис. 2). Нуклеиновая кислота БФ направляет синтез его ферментов. При этом инактивируются ДНК и РНК хозяина. Нуклеиновая кислота БФ реплицируется и направляет синтез новых белков капсида. Происходят самосборка капсида вокруг фаговой нуклеиновой кислоты и формирование БФ, которые выходят из бактерии в результате ее лизиса, выталкивания или в некоторых случаях почкованием. Из бактерии высвобождается 200–1000 новых БФ, которые инфицируют другие бактериальные клетки.
Умеренные БФ взаимодействуют с бактериями по продуктивному или интегративному типу. Продуктивный тип умеренного фага, как и у вирулентных фагов, заканчивается лизисом бактерий. При интегративном типе ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синхронно с бактериальным геномом, не вызывая ее лизиса (передается при делении бактерии). ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий – лизогенной, сам процесс – лизогенией (от греч. lysis – разложение, genea – происхождение).
Хромосома умеренного фага лямбда, введенная в бактерию, вызывает либо лизис, либо лизогенизацию (проникшая в бактерию ДНК умеренного фага приобретает форму кольца и интегрирует в строго определенную область хромосомы). Ультрафиолетовое облучение индуцирует литический процесс с выходом фага. При лизогении фаги не образуются в результате “выключения” фаговых генов репрессором, кодируемым одним геном фага.
Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующих агентов (ультрафиолетовые лучи, митомицин С и др.) дерепрессироваться, исключаться из хромосомы. Этот процесс заканчивается продукцией фагов (индукцией профага) и лизисом бактерий. Профаг придает бактерии новые свойства, что получило название фаговой конверсии (лат. conversio – превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, наличие профага в холерном вибрионе обусловливает его способность продуцировать холерный экзотоксин.
БФ применяют для профилактики, лечения инфекций, а также для диагностики (например, для фаготипирования с целью выявления источника инфекции). Кроме того, БФ используют в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК; возможна также естественная передача генов между бактериями посредством трансдукции.
Фаготипирование – один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. При внутривидовой идентификации бактерий, т. е. при определении фаговара (фаготипа) бактерий с помощью фаготипирования, на чашку Петри с плотной питательной средой, засеянную чистой культурой возбудителя в виде “газона”, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Бактерии, чувствительные к фагу, лизируются (образуется стерильное пятно, “бляшка”, или т. н. негативная колония фага).
БФ – уникальное явление; они участвуют в разнообразных процессах:
- в передаче лекарственной резистентности при трансдукции, особенно у стафилококков;
- лизогенная конверсия приводит к приобретению новых характеристик бактерий;
- случайная инсерция (вставка) в бактериальную хромосому может вызывать инсерционную мутацию;
- в эпидемиологическом типировании бактерий (фаготипировании);
- в лямбде БФ – модельной системе для изучения латентной инфекции;
- БФ используются в генной инженерии как векторы и библиотеки генов;
- БФ ответственны за естественное удаление бактерий; используются для профилактики и лечения некоторых инфекций.
Получение эффективных лечебно-профилактических БФ связано с тщательным и постоянным поиском штаммов с широким спектром (валентностью) действия на бактерии и высокой степенью их литической активности. Литическая активность и, следовательно, лечебная, а также профилактическая эффективность препаратов БФ зависят от видовой, инфравидовой принадлежности возбудителя, его рецепторных особенностей и факторов его микроокружения. Например, антитела и другие гуморальные белки могут заблокировать участки связывания бактерий с БФ, что исключает возможность парентерального введения последних. Кроме того, возможно быстрое формирование резистентности бактерий к применяемым БФ. Для получения лечебного эффекта при неблагоприятных бактериальных ассоциациях препараты БФ выпускают либо поливалентными, направленными против различных видов и сероваров одного возбудителя, либо комбинированными, содержащими БФ против различных видов возбудителя.
БФ не вызывают побочных реакций, не нарушают нормальную микрофлору. При дисбактериозе, нарушениях функций кишечника, обусловленных развитием местных воспалительных процессов, подавлении резидентной микрофлоры, происходит активация ряда условно-патогенных микроорганизмов и транзиторной микрофлоры. Эти обстоятельства поднимают значимость селективной деконтаминации, проводимой с помощью антибиотиков направленного действия и литических БФ.
БФ, обладая специфичностью действия против определенных возбудителей острых кишечных инфекций, могут также вносить вклад в развитие оральной толерантности. Известно, что организм человека проявляет пероральную (региональную) толерантность к собственной нормальной микрофлоре. Эта толерантность обусловлена блокадой активации сигнальных рецепторов (например, толл-подобных рецепторов – TLR и др.) к компонентам микрофлоры человека и активностью регуляторных T-лимфоцитов (Treg), которых в свою очередь активируют NKT-клетки (natural killer T cells). Компоненты (паттерны) БФ и разрушенных ими бактерий могут активировать определенные сигнальные рецепторы клеток организма, стимулирующие синтез антимикробных пептидов, подавляющих развитие наиболее агрессивных микробов (рис. 3). Срыв оральной толерантности влечет развитие различных нарушений, в т. ч. хронического гастрита, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, некротизирующего энтероколита у детей, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Препараты БФ хранят при температуре 2–10 °С в сухом темном месте. БФ чувствительны к ультрафиолетовым лучам; даже их непродолжительное пребывание на свету приводит к утрате литической активности. Для защиты БФ от действия желудочного сока их выпускают в капсулах или таблетках, покрытых кислотоустойчивой оболочкой. Материалом защитного покрытия является нетоксичная целлюлоза, эстерифицированная уксусной и фталевой кислотами, образующая гладкую прозрачную пленку. Для детей из-за проблем проглатывания таблеток используют пектиновое покрытие. Пектин, обволакивая БФ, защищает их от разрушающего действия желудочного сока.
Нормализация микрофлоры, возможное участие БФ в поддержании колонизационной резистентности и оральной толерантности обеспечивают стабилизацию гуморального и клеточного звеньев иммунитета. Изредка применение БФ совпадает с ухудшением качества стула из-за массовой гибели чувствительных к нему бактерий. В этом случае для уменьшения интоксикации целесообразно назначать на ночь энтеросорбент – не ранее 3–4 часов после последнего приема БФ.
Препараты бактериофагов против возбудителей кишечных инфекций
Интести-бактериофаг жидкий содержит стерильные фильтраты фаголизатов шигелл (S. flexneri сероваров 1, 2, 3, 4, 6 и S. sonnei), сальмонелл (S. paratyphiA, S. paratyphiB, S. typhimurium, S. choleraesuis, S. infantis, S. oranienburg, S. enteritidis), энтеропатогенных кишечных палочек наиболее этиологически значимых сероваров (Escherichia coli О111, О55, О26, О125, О119, О128, О18, О44, О25, О20), протея (вульгарис и мирабилис), стафилококков, энтерококков и синегнойной палочки (Pseudomonas aeraginosa). Интести-бактериофаг (Bacteriophagum intestinalis fluidum) представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета различной интенсивности.
Препарат предназначен для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных вышеуказанными бактериями, их сочетанием (в т. ч. бактериальной дизентерии, сальмонеллеза, брюшного тифа, паратифа, дисбактериоза, энтероколита, колита, диспепсии). Его назначают в остром периоде болезни: монотерапия при легких и стертых формах, при бактериовыделении; комбинированная терапия с другими антибактериальными средствами (при среднетяжелом течении) или иммуномодуляторами (при затянувшемся бактериовыделении). Залогом эффективности использования интести-бактериофага является определение фагочувствительности возбудителя и раннее применение препарата, который назначают перорально или ректально при помощи клизмы. Перорально интести-бактериофаг назначают 3–4 раза в сутки натощак за 1,0–1,5 часа до еды в течение 7–10 дней и в разовой дозе: детям до 6 месяцев – 5–10 мл, 6–12 месяцев – 10–15 мл, 1–3 года – 15–20 мл, старше 3 лет – 20 – 40 мл (см. таблицу). Для детей первых месяцев жизни назначенный препарат в первые двое суток разводят кипяченой водой в 2 раза. Если побочные осложнения отсутствуют (срыгивания, высыпания на коже), препарат назначают неразведенным. Перед приемом интести-бактериофага детям старше 3 лет и взрослым назначают раствор питьевой соды (0,5 чайной ложки на 0,5 стакана воды) или щелочную минеральную воду. В отсутствие колитического синдрома препарат назначают ректально 1 раз в день после опорожнения кишечника.
Бактериофаг дизентерийный поливалентный (в таблетках с кислотоустойчивым покрытием и в свечах) содержит стерильные фильтраты фаголизатов шигелл (S. flexneri и S. sonnei). Применяют с 6-месячного возраста для лечения и профилактики бактериальной дизентерии. Для лечения его применяют перорально 3 раза в сутки за час до еды в течение 5–7 дней и в разовой дозе: для детей от 6 месяцев до 3 лет – по 1 таблетке, 3–8 лет – по 1–2 таблетки, старше 8 лет – 2–3 таблетки. При слабовыраженном колитическом синдроме и в период реконвалесценции третий прием БФ внутрь можно заменить его ректальным применением: с 6 месяцев до 3 лет – 20–40 мл, с 3 до 8 лет – 40–60 мл, старше 8 лет – 60–80 мл.
С профилактической целью рекомендуют ежедневный прием препарата в зависимости от возраста: по 10–40 мл или 1–2 таблетки.
Бактериофаг сальмонеллезный групп A, B, C, D, E в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в свечах, жидкий содержит стерильные фильтраты фаголизатов сальмонелл (S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S. enteritidis, S. anatum, S. newlands). Для лечения его применяют перорально 3 раза в день за час до еды в течение 7–10 дней и в разовой дозе: для детей 6–12 месяцев – по 0,5 таблетки; 1–3 лет – по 0,5–1,0; 3–8 лет – по 1,0; старше 8 лет – по 2 таблетке. Третий пероральный прием можно заменить ректальным введением препарата. С профилактической целью БФ назначают детям по 1 таблетке и взрослым по 2 таблетке 2 раза в неделю.
Бактериофаг брюшнотифозный в таблетках с кислотоустойчивым покрытием содержит стерильный фильтрат фаголизата сальмонелл брюшного тифа (S. typhi). Препарат назначают для профилактики брюшного тифа внутрь за час до еды детям от 6 месяцев до 3 лет по 1 таблетке, а старше 3 лет и взрослым – по 2 таблетке 1 раз в 3 дня или каждый день до выздоровления.
Бактериофаг колипротейный жидкий содержит стерильные фильтраты фаголизатов энтеропатогенных (диареегенных) кишечных палочек (Escherichia coli наиболее распространенных серологических групп O20, O26, O33, O44, O55, O111, O119, O26, O124, O125, O127, O151), Proteusvulgarisи Proteusmirabilis. Препарат предназначен для лечения и профилактики заболеваний, вызванных вышеуказанными бактериями, а также дисбактериоза.
Сфера применения других препаратов бактериофагов многообразна; они используются как для местного применения (“раневые” бактериофаги), так и для приема перорально или ректально, в т. ч. в зависимости от формы выпуска:
- бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный жидкий;
- бактериофаг клебсиеллезный поливалентный очищенный жидкий;
- бактериофаг коли жидкий;
- бактериофаг протейный жидкий;
- бактериофаг псевдомонас аэругиноза (синегнойный) жидкий;
- бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE в свечах;
- бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE жидкий;
- бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием;
- бактериофаг стафилококковый в аэрозольной упаковке;
- бактериофаг стафилококковый в свечах;
- бактериофаг стафилококковый для инъекций жидкий;
- бактериофаг стафилококковый жидкий;
- бактериофаг стрептококковый жидкий.
В заключение следует отметить, что БФ и препараты БФ характеризуются многими положительными сторонами, они:
- безопасны, в т. ч. не токсичны, для человека;
- высокостабильны при длительном хранении;
- обладают строгой специфичностью действия на определенные виды бактерий и эффективностью как в качестве монотерапии, так и в сочетании с антибиотиками;
- не нарушают нормальную микрофлору;
- способны к самовоспроизведению и саморегуляции численности.
Информация об авторах:
Быков Анатолий Сергеевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии,вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО “Первый МГМУ им. И.М. Сеченова” Минздравсоцразвития РФ.
Тел. 8 (495) 629-75-79, e-mail: bykov@imail.ru;
Быков Сергей Анатольевич – кандидат медицинских наук, ассистент кафедры клиническойиммунологии и аллергологии ГОУ ВПО “Первый МГМУ им. И.М. Сеченова” Минздравсоцразвития РФ.
