Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является труднопреодолимым для большинства лекарственных веществ [1, 2]. Это обусловлено наличием гликопротеина-Р, осуществляющего выброс (выкачивание) вещества из цитоплазмы эндотелиоцитов, а также наличием плотных контактов (tight junction) между эндотелиоцитами капилляров головного мозга, их малой фенестрацией, что затрудняет фильтрацию [3]. Одним из способов облегчения транспорта лекарственных веществ через ГЭБ является их сорбция на альбуминовых и поли(бутил)цианоакрилатных наночастицах (ПБЦА-НЧ), покрытых полисорбатом-80 (ПС-80) [4–10, 16, 17].
Материал и методы
Опыты проводились на белых беспородных мышах массой 18–22 г. Животных содержали в клетках по 10 особей в условиях 12-часового светового дня при температуре 20–22 °С при свободном доступе к пище и воде. С учетом специфики суточных ритмов мышей и целью уменьшения их влияния на результаты исследования анальгезиметрические исследования проводились в одно и то же время суток (14 часов).
Приготовление лекарственных форм на основе ПБЦА-НЧ
ПБЦА-НЧ получали и лиофилизировали, как описано в протоколе [4].
Суспензия ПБЦА-НЦ с сорбированным даларгином. НЧ ресуспендировали в фосфатном буфере при постоянном помешивании и 5-минутном “озвучивании” (при помощи ультразвукового диспергатора УЗДН). Это производилось с таким расчетом, чтобы концентрация ПБЦА-НЧ составляла 20 мг/мл. Затем к суспензии добавляли раствор даларгина (0,75–1 мг/мл) и инкубировали в течение 4 часов при периодическом перемешивании.
Суспензия ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином, покрытых ПС-80. Суспензию ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином готовили, как описано выше. Затем к суспензии добавляли 1 %-ный раствор ПС-80 и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 минут.
Суспензия ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином, покрытых аполипопротеинами. Суспензию ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином готовили, как описано выше. Затем к суспензии добавляли растворы аполипопротеинов (Аро): АроА-II (12,5 мкг/мл), АроВ (12,5 мкг/мл), АроС-II (12,5 мкг/мл), АроЕ (12,5 мкг/кг), АроJ (12,5 мкг/кг), и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 минут.
Суспензия ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином, покрытых ПС-80 с суперпокрытием Апо. Суспензию ПБЦА-НЧ с сорбированным даларгином, покрытых ПС-80, готовили, как описано выше. С целью суперпокрытия добавляли растворы АроА-II, АроВ, АроС-II, АроЕ или АроJ (в концентрациях 12,5 мкг/кг) и инкубировали в течение 60 минут.
Методика проведения анальгезиметрических исследований
Антиноцицептивное действие даларгина (в разных лекарственных формах) изучали в тесте “отдергивания хвоста” (tail-flick test) с использованием прибора Iitic-Inc., mod. 33, “Tail flick analgesia-meter”, как описывалось ранее [4]. При этом на дистальную треть хвоста животного наносится термическое кожное болевое раздражение пучком сфокусированных линзой световых лучей от лампы накаливания. Таким образом, кожноболевое раздражение наносится бесконтактным способом и тем самым снижается вероятность реагирования животного на тактильную стимуляцию. При неизмененной термической болевой чувствительности реакция животного на ноцицептивную стимуляцию проявляется резким отдергиванием хвоста (tail-flick) от пучка световых лучей. Период времени, проходящий между началом стимуляция и отдергиванием хвоста, фиксируется как латентный период реакции отдергивания хвоста (ЛП-РОХ). У животных с неподавленной болевой чувствительностью ЛП-РОХ колеблется в пределах 1,5–3,2 секунды. Если лекарственное вещество обладает антиноцицептивным действием, то после его введения ЛП-РОХ повышается.
В ходе эксперимента животных помещали по одному в прозрачные пластиковые ячейки. После 30-минутной адаптации в ячейках у животных измеряли ЛП-РОХ до введения лекарственной формы. Через 15 минут контрольный замер ЛП-РОХ повторяли.
Тотчас после контрольного замера ЛП-РОХ животным вводили даларгин в различных лекарственных формах. При этом лекарственные препараты вводили внутривенно в боковую вену хвоста в объеме 0,2 мл на животное. Все животные каждой из групп получали один и тот же препарат в одинаковой дозе.
Через 15 минут после введения препарата начинали измерять ЛП-РОХ. Замеры производили с интервалом 15–30 минут (на 15-й, 30-й, 45-й, 60-й, 90-й). Многократные замеры ЛП-РОХ позволяли проследить развитие антиноцицептивного действия препарата в динамике. Анальгезиметрическое исследование животного прекращали тогда, когда значение ЛП-РОХ восстанавливалось до значения, полученного перед введением препарата.
Об антиноцицептивном действии судили, сопоставляя среднее значение ЛП-РОХ в группе до введения лекарственной формы (ЛП-РОХ 1) со средними значениями РОХ после введения лекарственной формы (ЛП-РОХ 2). Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента. Кроме того, для каждого замера ЛП-РОХ 2 высчитывали показатель “Процент максимального эффекта” (ПМЭ), который рассчитывали по формуле:
где Cut-off time – предельное время термической болевой стимуляции.
Методика проведения эксперимента
Животные (75 особей) были разделены случайным образом на 15 групп по 5 животных в каждой. Животным каждой группы в боковую вену хвоста вводили по 0,2 мл следующих лекарственных форм:
Группа 1 – суспензия ПБЦА-НЧ – плацебо.
Группа 2 – даларгин (7,5 мг/кг) в растворе.
Группа 3 – раствор даларгина (7,5 мг/кг) с ПС-80.
Группа 4 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ.
Группа 5 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых АроА-II (12,5 мкг/кг).
Группа 6 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых АроВ (12,5 мкг/кг).
Группа 7 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых АроС-II (12,5 мкг/кг).
Группа 8 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых АроЕ (12,5 мкг/кг).
Группа 9 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых АроJ (12,5 мкг/кг).
Группа 10 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80.
Группа 11 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и АроА-II (12,5 мкг/кг).
Группа 12 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и АроВ (12,5 мкг/кг).
Группа 13 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и АроС-II (12,5 мкг/кг).
Группа 14 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и АроЕ (12,5 мкг/кг).
Группа 15 – даларгин (7,5 мг/кг), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и АроJ (12,5 мкг/кг).
После введения лекарственных форм проводили анальгезиметрическое исследование с расчетом ПМЭ.
Результаты
Результаты исследования представлены в таблице. Из них следует, что на 30-й минуте исследования статистически достоверное увеличение ПМЭ по сравнению с группами контроля (группы 1–4) наблюдалось в группах 6 и 8 (покрытие АроВ и АроЕ). Тем не менее этот эффект оказался менее выраженным, чем в группе 10 (покрытие ПС-80). В то же время максимальное увеличение ПМЭ показано для групп, в которых применяли покрытие ПС-80 с суперпокрытием аполипопротеинами АроВ, АроЕ и АроJ (группы 12, 14, 15). Кроме того, в группе 14 анальгетическое действие было длительным (прослеживалось в течение всего периода наблюдения). В группе 11 (покрытие ПС-80 и суперпокрытие АроА-II) анальгезия развивалась к 90-й минуте исследования. Следует отметить, что в группах с использованием покрытия ПС-80 (группы 10–15) наблюдалось чрезмерное возбуждение животных, что говорит о возможных побочных эффектах взаимодействия транспортных полимерных наночастиц, ПС-80 и действующего вещества.
Примечание. Колонка П – поведение (А – аномальное поведение).
* Статистически достоверные различия при 2 р ≥ 0,05 в сравнении с ПБЦА-НЧ без покрытия (группа 1).
** Статистически достоверные различия при 2 р ≥ 0,05 в сравнении с ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 (группа 10).
Обсуждение
Таким образом, согласно результатам исследования, АроА-II, АроС-II и АроJ не оказывают существенного влияния на транспорт даларгина в ПБЦА-НЧ через ГЭБ. Напротив, АроВ и АроЕ способны увеличивать транспорт даларгина в ПБЦА-НЧ через ГЭБ, однако эта их способность ниже, чем у ПС-80. Наиболее выраженное увеличение транспорта даларгина в мозг достигается покрытием ПБЦА-НЧ ПС-80 с суперпокрытием АроВ и АроЕ. Такое покрытие ПБЦА-НЧ приводит не только к усилению, но и к пролонгированию антиноцицептивного действия даларгина.
ПБЦА-НЧ сами по себе обладают низкой способностью транспортировать даларгин через ГЭБ [11]. Это подтверждается отсутствием антиноцицептивного эффекта даларгина в группе 4.
Низкая транспортная эффективность ПБЦА-НЧ без специального покрытия объясняется двумя обстоятельствами:
1. НЧ могут захватываться клетками печени, что приводит к уменьшению их концентрации в сосудистом русле, в результате чего снижается концентрация транспортируемых веществ около эндотелиоцитов капилляров головного мозга [12];
2. поскольку одним из основных механизмов проникновения ПБЦА-НЧ через ГЭБ является рецептор-зависимый эндоцитоз, необходимо наличие на их поверхности активаторов эндоцитоза (например, аполипопротеинов).
В отсутствие активаторов НЧ с сорбированными веществами не распознаются специфическими рецепторами и, таким образом, либо не подвергаются эндоцитозу, либо подвергаются ему в незначительных количествах, что не позволяет создать достаточную концентрацию транспортируемого лекарственного вещества в мозге [13].
Как следует из экспериментальных данных, покрытие поверхности ПБЦА-НЧ ПС-80 вызывало значительное увеличение их транспортной функции, что проявлялось наличием выраженного антиноцицептивного эффекта в группе 10. Это может объясняться тем, что покрытие ПБЦА-НЧ ПС-80 способствует сорбции на их поверхности АроЕ из крови, что делает НЧ схожей с мицеллой липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и облегчает рецептор-зависимый эндоцитоз [14]. Это подтверждается данными о том, что покрытие ПБЦА-НЧ ПС-80 с суперпокрытием АроЕ (группа 14) дает больший эффект, чем их покрытие только ПС-80 (группа 10) или АроЕ (группа 8). Вероятно, подобное покрытие придает НЧ сходство с частицей ЛПНП. При этом НЧ за счет находящихся на ее поверхности АроЕ связывается с рецепторами к АроЕ в мембране эндотелиоцита, а затем, взаимодействуя с рецепторами ЛПНП, подвергается рецептор-зависимому эндоцитозу. После этого лекарственное вещество может высвобождаться внутрь клеток и диффундировать в мозг или же частицы могут перемещаться посредством трансцитоза [15]. Однако важно отметить, что наличие покрытия ПС-80 приводит к проявлению избыточной активности и агрессии в поведении животных в отличие от группы 8, в которой показан достаточно выраженный антиноцецептивный эффект в отсутствие подобных эффектов.
Относительно низкая способность других исследованных Апо (АроАII, АроС-II и АроJ) увеличивать транспорт даларгина в мозг, сорбированного на ПБЦА-НЧ, может объясняться их частичной десорбцией с поверхности частиц.
Выводы
1. ПБЦА-НЧ без специальной обработки не оказывают существенного влияния на транспорт даларгина в мозг.
2. Увеличение доставки даларгина, сорбированного на ПБЦА-НЧ, возможно путем их покрытия АроВ, АроЕ и ПС-80.
3. Максимальное увеличение доставки даларгина, сорбированного на ПБЦА-НЧ, наблюдается при их покрытии ПС-80 с последующим суперпокрытием АроЕ.
4. Выраженная эффективность доставки в отсутствие агрессии в поведении животных следует ожидать при разработке систем транспорта даларгина с использованием ПБЦА-НЧ с покрытием ApoE.
5. Обнаруженный эффект проявления агрессии животных при введении НЧ с покрытием ПС-80 и даларгина требует дальнейших исследований.
