Эпидемиология и актуальность проблемы
Герминогенные опухоли (ГО) являются сравнительно редкой патологией – около 1% от всех злокачественных новообразований у мужчин, однако в возрастной группе от 17 до 35 лет это основной вариант опухолей [1]. Свыше 90% ГО локализуются в яичке, первичные внегонадные опухоли средостения и забрюшинного пространства редки. За последние 10 лет в Европе и Северной Америке отмечается рост заболеваемости раком яичка на 10–30% [1]. В России за тот же период заболеваемость выросла на 45%. Благодаря высокой чувствительности ГО к химиотерапии это заболевание перестало быть фатальным. Так, в США 88% больных ГО живут 5 лет и более [1]. Заболеваемость ГО яичка в Российской Федерации в 2016 г. составила 1,9 на 100 тыс. мужского населения [39]. В 2017 г. в России зарегистрировано 1670 новых случаев ГО яичка и одновременно умерли по этой причине 600 больных, что в несколько раз хуже, чем в странах Западной Европы [36]. Высокая чувствительность ГО к современным противоопухолевым препаратам выделяет эту форму злокачественных новообразований из многочисленного ряда сóлидных опухолей и предоставляет онкологам уникальное поле деятельности по разработке новых более эффективных подходов к лечению этой патологии.
Онкомаркеры ГО и прогноз заболевания
Исключительно важный вклад в диагностику и стадирование ГО яичка вносит исследование сывороточных маркеров – α-фетопротеина (АФП), β-субъединицы хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Определение уровней АФП, ХГЧ, ЛДГ – обязательный компонент в диагностике, определении прогноза, оценке эффективности лечения и мониторинге заболевания больных ГО яичка.
Считается, что период полужизни для АФП сыворотки крови в среднем составляет 5–7 дней, для ХГЧ – примерно 2–3 дня. Повышение уровня АФП и/или ХГЧ отмечается приблизительно у 90% больных несеминомными ГО яичка. В то же время нормальный уровень маркеров не должен рассматриваться как аргумент, исключающий диагноз ГО [2].
АФП служит гликопротеином с молекулярной массой около 70 кД. Его молекула состоит преимущественно из белка и содержит только 4,5% углеводных остатков. АФП относится к группе онкофетальных антигенов и является структурным аналогом альбумина.
В норме АФП вырабатывается желточным мешком, печенью и желудочно-кишечным трактом плода. На ранних стадиях развития плода АФП заменяет альбумин и выполняет его транспортные функции. Физиологическая роль АФП для взрослых неизвестна. В возрасте старше 1 года верхняя граница нормы концентрации АФП в сыворотке крови соответствует 5 нг/мл.
Развитие ГО, содержащих элементы желточного мешка (эндодермального синуса), сопровождается существенным повышением уровня АФП. Однако при интерпретации результатов анализа всегда следует помнить, что повышение уровня этого маркера может отмечаться при других заболеваниях – гепатоцеллюлярном раке, опухолях желудка, желчного пузыря, поджелудочной железы, легких [2, 3].
Хорионический гонадотропин (ХГ) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 46 кД, состоит из двух субъединиц – α и β, для диагностики важна β-субъединица ХГ (ХГЧ). Нормой для взрослых мужчин считается уровень маркера в сыворотке крови <5 МE/л (мМE/мл). В ГО ХГ синтезируется трофобластическими структурами, причем степень повышения уровня сывороточного ХГ пропорциональна массе опухолевой ткани [3]. Необходимо иметь в виду, что уровень ХГ может повышаться также при новообразованиях поджелудочной железы, печени, желудка, легких, молочной железы, почек.
Повышенные концентрации ХГЧ в сыворотке могут присутствовать как при семиномных, так и при несеминомных опухолях. Тем не менее в отношении пациентов с уровнем ХГЧ>1000 МЕ/л необходимо рассмотреть возможность наличия несеминомного компонента опухоли. Пациенты с уровнем ХГЧ после орхофуникулоэктомии >5000 МЕ/л имеют повышенный риск возникновения метастазов в головном мозге [38].
ЛДГ представляет собой фермент с молекулярной массой 134 кД, в большом количестве вырабатывается мышечной тканью (в т.ч. миокардом) и имеет 5 изомеров, один из которых (ЛДГ-1) часто продуцируется опухолями яичка [2]. В норме уровень ЛДГ сыворотки крови колеблется в пределах 90–280 МЕ/л. Считается, что чувствительность и специфичность маркера для опухолей яичка невысоки; в качестве реального признака опухоли можно рассматривать повышение концентрации ЛДГ в сыворотке крови >2000 МЕ/л. ЛДГ отражает степень деструкции тканей, пропорциональна массе новообразования и может быть использована для прогнозирования течения болезни [2, 3].
Поскольку подходы к лечению семиномных и несеминомных ГО различаются, определение АФП и ХГЧ имеет очень большое практическое значение и часто эти маркеры оказываются более информативными, чем патоморфологическое заключение. Так, по совокупным литературным данным, высокие уровни ХГЧ позволяют распознавать трофобластические структуры, нераспознанные в рутинном патогистологическом рапорте, примерно в 10% семином и приблизительно в 30% несеминомных ГО. Практически не вызывает сомнений, что если у пациентов с семиномой уровень ХГЧ повышен, то в опухоли имеют место быть несеминомные элементы, влияющие на эффективность лечения и выживаемость [2–4].
Оценка скорости снижения уровня опухолевых маркеров
Скорость снижения уровня опухолевых маркеров после химиотерапии прогнозирует ответ на лечение. Устойчивое повышение уровня маркера или удлинение полупериода его жизни в первые 6 недель после химиотерапии указывает на резистентность опухоли и плохой прогноз. Пациенты с остаточной опухолевой массой после проведения химиотерапии, как правило, подвергаются оперативному лечению. Однако в случаях устойчивого повышения уровня маркеров показана интенсификация режимов химиотерапии [14, 15].
Случается, что «безмаркерная» до лечения опухоль при рецидиве начинает продуцировать один или оба маркера, поэтому проведение мониторинга с исследованием обоих маркеров (АФП, ХГЧ) обязательно. Следует также учитывать, что в опухолях со смешанным типом клеток снижение концентрации АФП и ХГЧ после резекции отражает соответствующее уменьшение опухолевой массы, в то время как снижение уровней маркеров после химиотерапии отражает поведение маркер-положительного типа клеток [14, 15].
После полного удаления опухоли уровни маркеров должны снижаться до нормальных значений в соответствии с их полупериодами жизни: для АФП <5 дней, для ХГЧ – 1–2 дня. Устойчивое повышение уровней АФП и ХГЧ после орхэктомии показывает, что опухоль не ограничена яичком и необходимо проведение первой линии химиотерапии. Повышенные концентрации опухолевых маркеров могут свидетельствовать о прогрессировании заболевания задолго до появления клинических признаков – иногда за 1–6 месяцев до клинического диагностирования рецидива. Повышенный уровень маркеров или нарастание их уровня даже в отсутствие клинических или радиологических находок подразумевают активную болезнь и служат основанием для начала лечения. Если наблюдается выход клиренса маркеров на плато или на его замедление, это свидетельствует об остаточной активной болезни. При мониторинге больных повышение уровня АФП и/или ХГЧ является первым индикатором рецидива приблизительно в 50% случаев. Параллельное определение концентрации АФП (верхняя граница нормы 5 ЕД/л) и ХГЧ (верхняя граница нормы 5 ЕД/л) дает диагностическую чувствительность в отношении рецидива 86% при специфичности 100%; положительное прогностическое значение 100% [5–7, 14].
Кроме перечисленных выше маркеров, определение которых считается обязательным, существуют дополнительные тесты, выполняемые значительно реже – в зависимости от конкретных обстоятельств [3]. К числу таких анализов может быть отнесено исследование уровней плацентарной щелочной фосфатазы (PLAP) и нейронспецифической энолазы (NSE). В одном небольшом исследовании показано, что данные маркеры специфичны для семиномы, а также их уровни снижаются в ответ на терапию [4]. Однако PLAP и NSE обладают низкой чувствительностью к ГО, их уровень в сыворотке часто повышается у курильщиков в отсутствие рака яичка, ограничивая его пользу в качестве маркера ГО [37]. Следует отметить, что данные маркеры в настоящее время не нашли места в клиническом применении.
Перспективные молекулярно-генетические маркеры
Перспективными новыми маркерами ГО являются циркулирующие внеклеточные ДНК, которые могут быть обнаружены при различных злокачественных новообразованиях, включая рак предстательной железы, мочевого пузыря, легких и молочной железы. [5–8]. Они высокостабильны в сыворотке и плазме, устойчивы к эндогенным рибонуклеазам и неблагоприятным физическим условиям, что позволяет эффективно выделять циркулирующие микро-РНК из биологических жидкостей, их количество может быть измерено с высокой чувствительностью и специфичностью с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, ДНК-микрочипов и метода РНК-секвенирования. Также они имеют стабильный и сходный уровень экспрессии в норме у мужчин и женщин, а также у лиц разного возраста. Таким образом, циркулирующие микро-РНК обладают многими характеристиками «идеального биомаркера». Повышенные уровни обнаружены у пациентов как с семиномой, так и с несеминомой. Чувствительность и специфичность в диагностике ГО составили 88 и 97% соответственно [6].
Микро-РНК
Увеличение числа случаев ГО среди мужчин обеспечивает сильную мотивацию для понимания его биологической и генетической основы. Морфологическая гетерогенность данного типа опухолей вызывает трудности в классификации и гистологической диагностике. В последние десятилетия благодаря новым инструментам молекулярной биологии ГО были изучены более подробно, разработан ряд новых диагностических маркеров, также было обнаружено много потенциальных терапевтических мишеней. Среди этих биомаркеров микро-РНК привлекли особое внимание.
Микро-РНК представляют собой небольшие некодирующие РНК длиной 19–23 нуклеотида. Будучи прямо вовлеченными в регуляцию всех ключевых клеточных процессов, включая развитие, дифференциацию, пролиферацию, метаболизм и смерть клетки, микро-РНК могут выступать в качестве биомаркеров рака. Было найдено, что регуляция микро-РНК нарушена при большинстве болезней человека, включая рак [9, 10]. Предшественники микро-РНК производят транскрипцию как из кодирующих участков генов (экзонов), так и из некодирующих участков (интронов). Пока что функциональными признаны около 1000 микро-РНК. По оценкам, человеческие клетки могут содержать более 10 тыс. различных микро-РНК [11].
Микро-РНК обладают большим потенциалом в качестве новых биомаркеров, поскольку их легко и относительно недорого обнаружить с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, также они отличаются стабильностью в жидкостях организма.
Недавно было продемонстрировано, что микро-РНК кластера miR-371-3 и кластеров miR-302 и -367 сверхэкспрессируются в сыворотке всех мужчин с несеминомными ГО яичка вне зависимости от распространения опухолевого процесса [12–15]. Также авторы продемонстрировали, что сывороточный уровень микро-РНК значительно снизился после первого цикла химиотерапии и это послужило лучшим предиктором ответа на химиотерапию по сравнению со стандартными биомаркерами (85 против 25%) [16].
В другом сравнительно небольшом исследовании успешно продемонстрировано, что уровень микро-РНК-367-3p, -371a-3p, -372-3p и -373-3p в сыворотке был значительно выше у пациентов с ГО по сравнению со здоровыми субъектами и пациентами с доброкачественным заболеванием яичка. Чувствительность микро-РНК-371a-3p составила 84,7%, специфичность – 99%, эти показатели выше, чем у любого другого используемого в настоящее время биомаркера [17]. Очевидна перспективность использования этих маркеров в клинической практике для диагностики, анализа эффективности лечения и прогноза заболевания.
Молекулярно-генетические особенности ГО яичка
К молекулярным характеристикам ГО опухолей относится наличие дополнительного материала короткого плеча 12-й хромосомы (12p), что характерно как для семиномы, так и для несеминомы. В 80% случаев это происходит в результате образования изохромосомы 12, в 20% случаев дополнительный материал 12р появляется в результате хромосомной перестройки или амплификации небольшого района короткого плеча 12-й хромосомы [19]. В данном участке расположены гены-кандидаты, участвующие в патогенезе ГО яичка, экспрессия которых усиливается в результате увеличения дозы генов, что связано с появлением дополнительного хромосомного материала. С одной стороны, это гены KRAS и циклин D2 (CCND2), связанные со злокачественной трансформацией и пролиферацией клеток. С другой стороны, в данном участке расположен кластер генов, связанных с поддержанием стволового потенциала клеток и их плюрипотентных свойств, который включает гены STELLA, NANOG, EDR1, GDF3 [20]. Кроме изменений 12-й хромосомы для ГО яичка характерны анеуплоидии по 7-й, 8, 21-й и X-хромосомам, а также триплоидии, которые чаще выявляются в семиномах. При исследовании экспрессионных профилей и паттернов импринтинга показано, что ГО яичка происходят из первичных половых клеток или гоноцитов. Инициация опухоли осуществляется еще при внутриутробном развитии и заканчивается преинвазивной стадией, которую называют внутриканальцевой герминогенно-клеточной неоплазией (ВКГКН). Большинство (90%) клинических случаев ГО яичка содержат элементы ВКГКН. Мужчины, у которых при биопсии яичка выявлены очаги ВКГКН, имеют 50%-ную вероятность развития опухоли в течение 5 лет [21]. Экстрагонадные опухоли зародышевых клеток, как правило, возникают в районах миграционного пути первичных половых клеток в процессе эмбрионального развития. ГО яичка тесно связаны с нарушением развития мужского урогенитального тракта, особенно с крипторхизмом, при котором риск развития опухоли повышается от 2 до 8 раз, также к факторам риска относят бесплодие. Все эти признаки формируют синдром тестикулярной дисгенезии [22].
Реакция на повреждения ДНК и передача сигналов p53
С появлением методов секвенирования нового поколения за последние несколько десятилетий были достигнуты большие успехи в понимании биологии опухолевых клеток. Они включают характеристику предиктивных наследуемых факторов, которые предрасполагают к развитию ГО, и более широкое понимание сигнальных каскадов, вовлеченных в онкогенез. Атлас генома рака завершил всесторонний анализ 137 образцов, предоставив данные об изменениях числа копий, профиле соматических мутаций, экспрессии РНК, статусе метилирования и других молекулярных характеристиках ГО. В этом анализе только три гена соответствовали порогу значимости для повторяющихся соматических мутаций: KIT (18%), KRAS (14%) и NRAS (4%). Эти мутации, как известно, встречаются при ГО, они были обнаружены только в опухолях с семиномными компонентами. Периодические очаговые усиления также были зарегистрированы в MDM2 [23].
Частота мутаций пути p53, которая включает амплификацию MDM2 и MYCN, составляет приблизительно 25% среди пациентов с платинорезистентным заболеванием, причем наибольшую долю составляют мутации у пациентов с несеминомными ГО средостения [24]. Интактная передача сигналов p53, которая служит критическим компонентом реакции на повреждение ДНК, часто рассматривается как основная причина того, что ГО представляют чрезвычайную чувствительность к препаратам платины. Образование комплексов платина-ДНК вызывает искажения в двойной спирали ДНК, приводя к остановке клеточного цикла и/или апоптозу через рекрутирование факторов транскрипции и реакции на повреждения ДНК, включая p53 [25]. Функциональная потеря передачи сигналов p53 приводит к недостаточной регуляции клеточного цикла, связана с более агрессивными опухолями и резистентностью к терапии [24, 25].
Как это ни парадоксально, но для ГО характерна высокая экспрессия p53 дикого типа как в цитоплазме, так и в ядре [24, 26]. Наряду с сверхэкспрессией p53 может происходить сверхэкспрессия различных ингибиторов p53, в т.ч. miR-371-373 и miR-367, меченных LATS2, и онкопротеина MDM2. Функция белка MDM2 первоначально была установлена у мышей, отсюда название MDM2 (mouse double minute chromosome amplified oncogene) [27, 28]. MDM2 выполняет свою ингибирующую роль за счет ядерного экспорта и убиквитилирования р53, что приводит к его деградации. Функциональная апоптотическая передача сигналов p53 вносит вклад в опосредованную платиновую цитотоксичность, поэтому лекарственное ингибирование MDM2 может приводить к активации p53 и повышенной чувствительности к платине [28, 29]. Амплификация MDM2 представляет собой привлекательную терапевтическую мишень с множеством ингибиторов, над которыми в натоящее время ведутся активные исследования. Нутлин-3 (Nutlin-3) является ингибитором MDM2, который приводит к накоплению р53 и ее транскрипционных мишеней [30].
Поскольку путь p53 должен быть преодолен, чтобы избежать вызванного онкогеном апоптоза, многие злокачественные опухоли содержат инактивирующие мутации в самом p53, что делает попытки активировать этот сигнальный путь неэффективными [30]. Тем не менее большинство ГО, включая платинорезистентные опухоли, экспрессируют p53 дикого типа, что делает их идеальной мишенью для терапии посредством этого механизма [31]. Эксперименты in vitro показывают, что обработка нутлином-3 вызывает накопление р53 и до 10-кратного увеличения чувствительности платины в клетках NTERA2 и 2102EP ГО, которые экспрессируют p53 дикого типа, но не оказывают влияния на клетки, экспрессирующие мутантный p53 [32, 33]. Аналогичные результаты описаны при немелкоклеточном раке легкого, раке яичников и носоглотки, что указывает на широкий потенциал ингибирования MDM2 в сочетании с терапией на основе препаратов платины [33–35]. Апоптотическая передача сигналов р53 после повреждения ДНК может происходить путем модуляции активности митохондриальных сигнальных молекул апоптоза, таких как Bcl-2, Bax и Bak.
Заключение
Клиническое применение современных онкомаркеров ГО, таких как АФП, ХГЧ и ЛДГ, в диагностике, стратификации риска и оценке ответа на лечение имеет большое значение, однако их значение не абсолютно и не исключает наличия как ложноотрицательных, так и ложноположительных ответов. Выявление более чувствительных биомаркеров имеет большую клиническую значимость. В последние десятилетия благодаря новым инструментам молекулярной биологии ГО изучены более подробно, разработан ряд новых диагностических маркеров, среди которых особое внимание уделяется микро-РНК. Внедрение в практику новых высокочувствительных биомаркеров может изменить взгляд на адъювантное лечение, динамическое наблюдение, а также интенсификацию режимов химиотерапии. Важное направление в лечении ГО – это индивидуализация лекарственной терапии, поиск молекулярно-биологических факторов, чему и будут посвящены дальнейшие исследования.
